The Nature of Animal Light E. Newton Harvey 879 downloads.pdf

古腾堡计划电子书：《动物光线的本质》
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书名：《动物光线的本质》
作者：E. 牛顿·哈维
发布日期：2010年11月26日 [电子书编号#34450]
语言：英语
更多信息及格式：www.gutenberg.org/ebooks/34450
制作团队：Simon Gardner、Bryan Ness以及http://www.pgdp.net上的在线校对团队（本书是由谷歌打印项目中的公共领域资料扫描而成的。）

*** 古腾堡计划电子书《动物光线的本质》开始 ***

抄写者备注

此版本的电子书使用了部分Unicode符号。如果以下字符无法显示，您可能需要在浏览器中选择Unicode字体：

⇆（左箭头在上，右箭头在下）
α β γ λ ν π υ（希腊字母）
♀ ♂（女性与男性）

文中出现的化学物质名称的罕见写法也被保留了下来，例如用“atropin”表示“atropine”，用“asparagin”表示“asparagine”等。文中“Sidot blend”与“Sidot blende”的拼写可互换使用。原文中的某些格式与标点符号上的不一致之处也得以保留。“PH”或PH（H在P下方）这一表示酸碱度刻度的符号仍按原文样式使用，而现代更常见的写法则是“pH”。摩尔浓度的表示方式有多种（小写m、斜体小写m、小大写m），这些格式均与原文一致。只有那些明显的拼写或排版错误才进行了修改，这些修改内容列在书的末尾。

前言
目录
参考文献
索引

实验生物学专著系列
主编：

雅克·洛布，洛克菲勒研究所
T. H. 摩根，哥伦比亚大学
W. J. V. 奥斯特豪特，哈佛大学

《动物光线的本质》
作者：E. 牛顿·哈维，博士

实验生物学专著系列已出版著作：
《强迫运动、向性反应与动物行为》，雅克·洛布著，洛克菲勒研究所
《初级神经系统》，G. H. 帕克著，哈佛大学
《遗传的物理基础》，T. H. 摩根著，哥伦比亚大学
《近亲繁殖与远亲繁殖：其遗传学与社会学意义》，E. M. 伊斯特与D. F. 琼斯著，哈佛大学巴斯西研究所
《动物光线的本质》，E. N. 哈维著，普林斯顿大学

正在筹备中
纯系遗传
作者：H. S. 詹宁斯，约翰霍普金斯大学
遗传过程的实验性改造
作者：R. 珍珠，约翰霍普金斯大学
形态发生物质在卵子中的定位
作者：E. G. 康克林，普林斯顿大学
组织培养
作者：R. G. 哈里森，耶鲁大学
活体组织的渗透性与电导率
作者：W. J. V. 奥斯特豪特，哈佛大学
生物体与环境中的酸碱平衡
作者：L. J. 亨德森，哈佛大学
生长的化学基础
作者：T. B. 罗伯逊，多伦多大学
运动中的协调机制
作者：A. R. 摩尔，罗格斯学院
更多内容即将推出

实验生物学专著系列

动物光线的本质
作者：

E. 纽顿·哈维，博士
普林斯顿大学生理学教授

费城与伦敦：J. B. 利平科特公司
版权所有，1920年，J. B. 利平科特公司所有
电印及印刷工作由J. B. 利平科特公司完成。
美国费城：华盛顿广场出版社。

编辑声明：
随着专业领域的日益细分，单凭一位作者已无法全面、深入地涵盖现代生物学的所有内容。这一现象在所有科学领域都存在，因此英国的学者们开始推出关于生物化学、生理学和物理学方面的系列专著。许多美国生物学家也决定为实验生物学的研究提供类似的机会。
不久前还只是以描述性和推测性为主的生物学，如今已经开始采用精确科学的方法，因为人们意识到……

持续的进步不仅需要实验，还需要定量实验。本系列专著的目的就在于尽可能强调并推动生物学的这一发展。实验生物学与普通生理学在方法与内容上其实是一门科学，因为二者都旨在从生物物质的物理化学构成角度来解释生命现象。因此，关于实验生物学的这一系列专著也将涵盖传统意义上的普通生理学领域。

雅克·洛布、T·H·摩根、W·J·V·奥斯特豪特

前言

生物发光，即动植物能够产生光的现象，一直令普通人惊叹不已，也让科学家们着迷。因此，有大量相关文献问世也就不足为奇了。不过，这些文献中的很大一部分仅仅是在记载某种动物具有发光能力，或是描述海洋中极为强烈的荧光现象。那些对光产生的本质及原因进行过更深入研究的人包括贝杰林克、R·博伊尔、达尔格伦、杜布瓦、埃伦伯格、克鲁肯伯格、曼戈尔德、麦克德莫特、莫利施、潘切里、普吕格、菲普森、夸特雷法日、斯帕兰扎尼以及特罗扬等人。其中有一些人还就此主题撰写了详尽的专著。

本书的目的并非要探讨生物发光的所有方面。关于这一现象的进化过程以及发光器官的结构与功能，完全可以另写成册，而本书只能简要涉及这些问题。此外，我也不会去探讨光的根本来源——究竟是电子振动所致还是其他原因。这个问题应该由物理学家来解答，尽管很有可能……

对动物发光现象的研究能够为我们提供关于光本质的重要信息。任何不考虑具有发光能力的动物所具有的特殊特性的光理论都是不完善的。我们将主要探讨动物发光的物理特性以及其产生背后的化学过程。自从最初认为光是由磷产生的、属于一种氧化反应以来，这一领域已经取得了巨大进展。虽然这个问题尚未完全解决，但已有了坚实的物理化学基础。某种物质会发生氧化反应，而这种物质究竟是什么、为何其氧化过程中会伴随光的产生，则是生物发光领域中两个更为根本的问题。通过阅读以下内容，便可了解我们在解决这些问题方面取得了怎样的进展以及取得的成效如何。

我非常感谢俄亥俄州克利夫兰市Nela研究所的W. E. Forsythe博士，他仔细阅读了第三章的手稿并提出了宝贵意见；同时也要感谢哈佛大学的Lyman教授，他对第二章也进行了类似的审阅。我还要感谢我的妻子，她帮忙校对了书稿；此外，还要感谢Jacques Loeb博士和W. J. V. Osterhout教授，他们为本书的撰写提供了许多有益的建议。我还要感谢日本东京帝国大学农业学院的C. Ishikawa教授，他慷慨地提供了Cypridina物种的相关材料。最后，我要感谢华盛顿卡内基研究所的支持，尤其是该研究所的海洋生物学主任Alfred G. Mayor博士。没有他们的支持，本书中所描述的许多研究工作都无法完成。

E. N. H.
新泽西州普林斯顿，
1919年10月

目录
章节页码
I. 发光生物 1
早期的记载与理论。“会发光的鱼和肉”
“海洋的燃烧”。发光生物在植物界与动物界的分布。二次发光现象。假性发光现象。圣埃尔摩之火、幽灵火。花朵的闪光现象。人类自身的发光现象。发光生物对人类的用途。
II. 发光与炽热 20
完整的光谱。辐射与温度。“冷光”。热致发光。磷光与荧光。摩擦发光与压电发光。晶体发光。化学发光。
III. 动物发光的物理特性 40
普金耶现象。动物发光的颜色与光谱。偏振现象。动物发光的效率。红外辐射。紫外线辐射。发光效率与视觉感知能力。能够穿透不透明物体的辐射的产生。动物发光的强度。总结。
IV. 发光器官的结构 67
光化学变化与化学光效应。眼睛与发光器官。细胞内与细胞外的发光现象。连续发光与间歇性发光。发光的周期性。发光细菌。夜光藻与发光颗粒。翼足类动物与发光腺细胞。鲤鱼科鱼类。发光腺。萤火虫。带有透镜、反射器、不透明层及彩色屏的发光器官。动物发光的用途与功能。
V. 光产生的化学原理，第一部分 85

波义耳与斯帕兰扎尼的实验。木头发光与煤炭燃烧。氧气与发光现象。二氧化碳与发光现象。发光过程中产生的热量。发光现象与呼吸作用。水与发光现象。菲普森的夜光素。荧光素与荧光酶。光敏素与光敏蛋白。前荧光素。氧荧光素。火萤素或荧光素。化学发光反应。“生物酶促发光。”

VI. 光产生的化学原理，第二部分 114
火萤的荧光素与荧光酶。磷虾的荧光素与荧光酶。鲤鱼萤的荧光素：其稳定性、在酸及酶作用下的水解、吸附、沉淀、盐析、溶解度及分布情况。鲤鱼萤的荧光素属于蛋白质吗？鲤鱼萤的荧光酶及其性质。鲤鱼萤的荧光酶是一种白蛋白。荧光酶的特异性。脂肪溶剂及麻醉剂对荧光酶的作用。氰化物对荧光酶的影响。氧荧光素。氧化反应的本质。

VII. 发光的动力学特性 143
用于发光的微量物质。反应速率与化学发光现象。温度与化学发光现象。分步氧化过程。浓度与生物发光现象。温度与生物发光现象。有荧光酶参与时的氧化反应与无荧光酶时的氧化反应。反应速率与生物发光的颜色。

动物发光的本质

第一章 发光生物
在萤火虫和发光蠕虫众多的地区，人们很早便已意识到动物能够发光这一现象。但直到显微镜得到完善之后，人们才证实海洋中的荧光、潮湿木材以及死鱼和死肉所发出的光都是由生物体产生的。亚里士多德曾提到过死鱼和死肉的发光现象，而亚里士多德与普林尼也都提到过潮湿木材的发光现象。1667年，罗伯特·波义耳通过大量实验表明，这三种光源以及发光蠕虫所发出的光都依赖于充足的空气供应；他还对发光木材的光与发光煤的光进行了有趣的比较。波义耳无法找出这种光的真正成因，因此早期关于其本质的见解其实相当荒诞。直到1800年，赫尔姆仍从他对发光鱼的实验中得出结论：这种光是“海洋鱼类的固有成分”，也是“鱼类死亡后首先释放出来的物质”。直到1830年，米凯利斯才怀疑死鱼发光是由某种生物引起的；1854年，赫勒将这种可疑的生物命名为“Sarcina noctiluca”。1875年，普吕格证明可以在培养基中接种少量发光鱼，这些鱼会像细菌菌落一样不断生长，如今我们已知所有死鱼和死肉发出的光都是由发光细菌造成的。
19世纪初期，由于气味相似，人们推测潮湿木材的发光现象与真菌的生长有关。1854年，赫勒发现了一些细小的丝状物，他将它们称为“Rhizomorpha noctiluca”，并认为它们才是发光的真正来源。现在我们知道，所有会发光的木材都是由于各种真菌的菌丝体所致，有时真菌的子实体也会发出光。许多早期探险家所描述的“海洋荧光”现象，同样完全是由微观和宏观的生物体所导致的。这些生物大多是水母或栉水母，它们会引发更为强烈、更明亮的闪光。

夜间常在轮船的尾迹或周围出现的那种光。前者是各种甲藻或囊藻，例如夜光藻（肉眼勉强可见），它们聚集在海面，数量往往非常多，以至于在白天会使海水变色（通常是粉红色或红色）；而在夜间一旦受到干扰，海水就会像一片火焰般发光。尽管贝克在1753年就已经将夜光藻认定为具有发光能力的生物，但对那些更早的观察者来说，海上的光芒仍是一种神秘的现象。1810年，麦克卡特尼在皇家学会发表演讲时，概述了当时存在的各种理论：“许多学者认为海上的光芒并非由发光生物造成的。马丁认为这是腐烂作用产生的；西尔伯施拉格则认为是磷的作用；J·迈耶教授则推测海面吸收了光线后再将其释放出来。巴戎和詹蒂尔则认为海上的光芒属于电现象，因为它是由于摩擦而产生的……我不想占用学会的时间来反驳这些猜测；提出这些观点的人既没有提供论据，也没有进行实验，而且这些观点与所有已确定的有关事实都不相符。能够在生命过程中发光这一特殊特性，仅存在于现代自然学家划分的最后一类动物中，即软体动物、昆虫、蠕虫以及藻类。”麦克卡特尼虽然认识到了这种光芒的真正成因，但他对那些能够发光的海洋生物的数量知之甚少，而且完全没有提及鱼类——许多鱼类即便在没有细菌感染的情况下也能自行发光。对动物界的调查表明，至少有36个目包含一种或多种已知具有发光能力的生物，还有几个目中的物种是否具备发光能力尚存疑问。在植物界，则有两个类群包含具有发光能力的生物。附带的动植物分类表中展示了这些发光生物的分布情况。那些含有确凿证据证明其具有自发光能力的物种所在的目以斜体标出。需要指出的是，在那些没有发光生物的动物类群中，并未进一步细分为不同的目。

表1 植物界与动物界中发光生物的分布

植物界
I. 藓状植物
藻类
蓝绿藻
绿藻
褐藻
红藻
地衣（由藻类与真菌共生形成的生物）
真菌
黏菌
裂殖菌（细菌）
光杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌、微球菌、微螺旋菌、弧菌。
丝状真菌
子囊菌（囊菌、酵母以及某些霉菌）
担子菌（黑粉菌、锈菌、蘑菇）
黑粉菌类
耳状菌类
木耳菌类
伞菌类（蘑菇）
伞菌、蜜环菌、平菇、马勃、牛肝菌、脐菌、小口蘑、马萨尼姆菌、鸡油菌、皮层菌。
腹菌类（臭角菌与泡球菌）

II. 苔藓植物
苔纲（肝苔）
藓纲（苔藓）

III. 蕨类植物
木贼纲
水蕴草纲（水蕴草、马尾藻等）

石松纲（石松类）
蕨纲（蕨类植物）

IV. 种子植物
裸子植物（苏铁、银杏、针叶树）
被子植物（单子叶及双子叶开花植物）

动物界
I. 原生动物（单细胞动物）
肉足纲
根足纲
日行虫纲
放射虫纲
海生放射虫、黏球虫、胶球虫、胶囊虫、球囊虫。
鞭毛虫纲
纤毛虫纲
领鞭毛虫纲
甲藻纲
角甲藻、围甲藻、原甲藻、火甲藻、锥甲藻、眼囊虫、两极甲藻、双壳甲藻、耳甲藻、球甲藻、裸甲藻。
囊鞭毛虫纲
夜光虫、火囊虫、细盘虫、紧壳虫。
孢子虫纲
纤毛虫

II. 多孔动物门（海绵）
钙质海绵亚门
六放海绵亚门
固着海绵亚门

III. 刺胞动物门
水螅纲（水螅及水母）
细水母纲或钟水母纲
水母型——欧蒂玛水母、菲阿里迪乌姆水母（分布于大洋洲）。

水螅型——Aglaophenia、Campanularia、Sertularia、Plumularia、Cellularia、Valkeria、Obelia、Clytia。
钵水母纲——Geryonia、Lyriope、Aglaura。
箱水母纲——Cunina。
管水母纲——Thaumantias、Tiara、Turris、Sarsia。
水螅型——？
珊瑚水母纲——Siphonophora，包括Abyla、Praya、Diphyes、Eudoxia、Hippopodius。
水母纲——Stauromedusae、Peromedusae、Cubomedusae、Carybdia、Discomedusae，以及Pelagia、Aurelia、Chrysaora、Rhizostoma、Cyanæa、Dianea、Mesonema。
刺胞动物门（珊瑚、海扇、海笔、海葵）——Actinaria、Madreporareia、Antipatharia、Alcyonaria，包括Alcyonium、Gorgonia、Isis、Mopsea；Pennatulacea，包括Pennatula、Pteroides、Veretillum、Cavernularia；Funicularia、Renilla、Pavonaria、Stylobelemon、Umbellularia、Virgularia？
栉水母纲——Cydippida、Pleurobranchia、Lobata，以及Mnemiopsis、Bolinopsis、Leucothea（Eucharis）。
海鞘纲

IV. 扁形动物门
涡虫纲（扁虫）
吸虫纲（寄生性扁虫）
绦虫纲（带状虫）
线虫纲（线形虫）

V. 线形动物门
线虫纲（圆虫）
毛首线虫纲
棘头虫纲
箭虫纲

VI. 轮虫门
轮虫纲（轮形动物）
腹毛类
棘口动物纲

VII. 软体动物门
苔藓动物门（珊瑚虫）
内肛动物门
外肛动物门
膜口动物、Scrupocellaria、Retepora？Flustra？
腕足动物门（灯壳贝）
箭石动物门

VIII. 环节动物门
原始环节动物（包括Dinophilus）
真环节动物
多毛纲
Chætopterus、Phyllochaetopterus、Telepsaris、Polynoë、Acholoë、Tomopteris、Odontosyllis、Lepidonotus、Pionosyllis、Phyllodoce、Heterocirrus、Polyopthalamus？寡毛纲

蚯蚓目、光蚓目、异环虫目（Eisemia）、微鞘虫目、Nonlea目、囊尾线虫目、八棘虫目。
海鞘目（Sipunculus）
水蛭目（Leeches）
黏口虫目（Myzostomus）

IX. 棘皮动物门
海星纲（Star-fish）
蛇尾纲（Brittle-stars）
蛇尾目
Ophiopsila、Amphiura、Ophiacantha、Ophiothrix、Ophionereis。
海参纲（Euryalida）
海胆纲（Sea urchins）
海参纲（Sea Cucumbers）
羽星纲（Feather-stars）

X. 节肢动物门
甲壳纲（Crabs、lobsters、shrimps等）
叶足纲
介形虫纲
Halocypris、Cypridina、Pyrocypris、Conchœcia、Cyclopina。
桡足纲
Metridia、Leuckartia、Pleuromma、Oncæa、Heterochæta。
蔓足纲
Phyllocardia
裂足纲
Nyctiphanes、Nematoscelis、Gnathophausia、Euphausia、Stylochiron、Boreophausia、Mysis？
十足纲
Sergestes、Aristeus、Heterocarpus、Hoplophorus、Acanthephyra、Pentacheles、Colossendeis
口足纲
头足纲
端足纲

等足目
爪足动物门（缓步动物）
多足纲（蜈蚣和马陆）
合弓纲
唇足纲
地龙类、Scolioplanes、Orya。
倍足纲
寡足纲
昆虫纲
无翅目（弹尾虫）
Lipura、Amphorura、Neanura
直翅目
脉翅目
蜉蝣的Teleganoides和Cænis？白蚁？
半翅目
双翅目（苍蝇）
Bolitophila和Ceroplatus的幼虫，Thyreophora？
鞘翅目（甲虫）
Pyrophorus、Photophorus、Luciola、Lampyris、Phengodes、Photuris、Photinus等。
鳞翅目
膜翅目
蛛形纲（蜘蛛）

XI. 软体动物门
双壳纲
原始腹足类
丝鳃纲
假瓣鳃纲
真瓣鳃纲
Pholas
七鳃纲
腹足纲（蜗牛、蛞蝓等）
前鳃亚纲
后鳃亚纲
Phyllirrhoë、Plocamopherus。

软体动物门
鞘鳃亚纲（齿形贝类）
头足亚纲（鱿鱼和章鱼）
四鳃类
十腕双鳃类
箭乌贼属、长尾乌贼属、灯笼乌贼属，
细灯笼乌贼属、灯笼乌贼属、无鳍乌贼属，
阿布拉利亚属、阿布拉利奥普西斯属、瓦塔塞尼亚属、安奇斯特罗凯鲁斯属，
泰利迪乌贼属、翼乌贼属、火乌贼属，
八腕乌贼属？、美丽乌贼属、史蒂乌乌贼属，
底栖乌贼属、透明乌贼属、纯色乌贼属，
触手乌贼属、鞭状乌贼属、克兰奇亚属、利奥克兰奇亚属，
圆壳乌贼属、利奇亚属、利古里埃拉属、幻影乌贼属，
托克苏玛属、巨型克兰奇亚属、白色克兰奇亚属，
水晶乌贼属、幻影乌贼属、加利特乌贼属，
科里诺玛属、亨塞尼乌贼属、深海乌贼属、罗斯西亚属？
异形乌贼属、虹彩乌贼属、 Sepiola属、隆德莱蒂亚属，
伊尼奥乌贼属、欧普里姆纳属、黑色乌贼属？

第十二章 脊索动物门
无头索动物门（舌鳎类）
舌鳎类、褶舌鱼类、舌鳎属
尾索动物门（海鞘类）
幼虫海鞘类
附肢海鞘类？
囊海鞘类
沙蚕属、多利乌姆属？
海鞘科
火海鞘属、阴茎海鞘属
无颅类（文昌鱼）
环口类
鱼类
板鳃亚纲
中心鲨属、棘鲨属、副中心鲨属、伊斯西斯属，
拉马尔古斯属、欧普罗克托米克鲁斯属、底栖蝙蝠鱼属？
全头亚纲
肺鱼

真骨鱼纲
Stomias、Chauliodus、Melanostomius、Pachystomias、
Bathophilus、Dactylostomius、Malacosteus、
Astronesthes、Ophozstomias、Idiacanthus、
Bathylychnus、Macrostomius、Gonostoma、Cyclothone、
Photichthys、Vinciguerria、Ichthyococcus、Lychnopoles、
Diplophos、Triplophos、Valenciennellus、Maurolicus、
Argyropelecus、Sternoptyx、Polyipnus、Ipnops？
Neoscopelus、Myctophum、Halosausus、
Xenodermichthys？Macrurus？Photoblepharon、
Anomalops、Porichthys、Leuciocornus、Mixonus？
Bassozetus？Oneirodes、Ceratias、Gigantactis、
Chaunax、Malthopsis、Halicmetus、Monocentris、
Lamprogrammus。

两栖纲（青蛙、蟾蜍、蝾螈）
爬行纲（蛇、蜥蜴、龟）
鸟纲（鸟类）
哺乳纲（哺乳动物）

在植物界中，已知能够发光的只有某些细菌、某些真菌，如果将甲藻也归为植物的话，那还包括甲藻中的Peridineæ类。目前已描述了多种具有荧光特性的细菌，它们在培养特性和结构上存在差异，被归入Bacterium、Photobacterium、Bacillus、Microspira、Pseudomonas、Micrococcus和Vibrio等属中。这些细菌还有诸如phosphorescens、phosphoreum、luminosum、lucifera等表示其发光能力的特定名称。

所有已知能够发光的真菌都属于担子菌门，这是真正真菌中规模最大、发育最完善的类群。无论是菌丝体还是子实体，或者两者同时，都可能具有发光能力。

在动物中，最为人熟知的发光生物包括甲藻类（如夜光藻）、水螅虫、水母、栉水母、海笔、翼手鱼以及其他海洋蠕虫、蚯蚓、蛇尾、各种甲壳类动物、多足类动物、萤火虫及其幼虫、两种软体动物——Pholas dactylus和Phyllirrhoë bucephala、鱿鱼、群体生活的海鞘类动物Pyrosoma，以及鱼类。所有能够发光的动物要么生活在海洋中，要么生活在陆地上。目前尚未发现任何淡水中的发光生物。在海洋生物中，绝大多数都是深海生物，正是在这些深海生物中，结构复杂的真正发光器官才得以最充分地发展。许多会发光的海洋生物存在于浮游生物中，而生活在近海的发光生物则相对较少。除了Pholas、Phyllirrhoë和鱿鱼之外，上述各类生物中都有一些种类可以在我们的海洋实验室中找到。虽然在美国也有能发光的蚯蚓和多足类动物，但它们极为罕见，很难被观察到。有些动物的成年个体之外，其胚胎甚至卵子也会发光。Lampyris的卵在卵巢内就会发出光，刚产下的卵也具有很强的发光性。这种光并非来自附着在卵上的发光组织，而是源自卵本身内部。Pyrophorus的卵同样具有发光性。正如Allman（1862年）、Agassiz（1874年）和Peters（1905年）所指出的，栉水母的各个发育阶段在受到刺激时都会发光，不过它们的卵本身并不发光。Schizopod的幼虫（Trojan，1907年）、桡足类的无节幼体（Giesbrecht，1895年）、翼手鱼的幼虫（Enders，1909年）以及蛇尾的幼体（Mangold，1907年）也能发出光。显然，发光现象在植物界和动物界中的分布并无规律可循。就好像这些生物类别被写在黑板上，然后有人往上面撒了一把沙子——沙子落在哪里，哪里就会出现一种能发光的物种。腔肠动物承受的“沙子”最多，因此发光现象在这一门类中更为普遍，也是该门类最典型的特征。在节肢动物中，发光生物则零星出现在彼此关系并不密切的不同类群中。在软体动物中，除了头足类之外，仅已知有两种能发光的物种。还有几个门类中根本不存在能发光的生物。有趣的是，同一个属中的不同物种也可能具有发光能力。

那些具有发光能力的物种与另一类亲缘关系密切的物种相比，后者则完全没有发光现象。似乎在直接的进化过程中并没有出现发光能力的发展，不过在那些拥有高度发达的发光器官的物种中，可以观察到结构复杂性逐渐增加的规律。虽然这份关于具有发光能力的属的清单力求完整，但其中无疑存在遗漏与不准确之处。任何试图确定究竟是哪种动物导致了在几乎所有海水样本中观察到的那些闪光现象的人，都会明白在众多非发光生物中找出具有发光能力的生物是多么困难，尤其是当该生物体型极微小时。因此，在相关文献中出现许多关于发光动物的错误报道也就不足为奇了，我们在认定某个案例属于发光现象时必须格外谨慎。其难点主要在于：除了细菌、真菌以及少数鱼类之外，所有具有发光能力的生物都只有在受到刺激时才会发光；虽然很容易看到闪光，但生物本身却会在闪光之间消失不见。检测这类生物的唯一可靠方法是在海水中加入少量氨水。这会慢慢杀死这些生物，从而使具有发光能力的生物发出持续稳定的光亮，这一现象正是生物死亡时的特征。然而，并非所有观察者都采用这种方法。我们必须始终警惕，不要将所谓具有发光能力的生物发出的光误认为是真正具有发光能力的生物所发出的光。目前已知，所谓海洋藻类具有发光能力的现象，其实是由于生活在藻类上的水螅虫或单细胞生物造成的。我们还知道，许多非发光生物不仅在死亡后，甚至在存活期间都可能被发光细菌感染，因此它们的发光现象纯属次要现象。Giard和Billet（1889-90）成功地将发光细菌接种到多种端足类甲壳动物（如Talitrus、Orchestia、Ligia）以及等足类甲壳动物（如Porcellio、Philoscia）体内，在某些情况下，这种感染甚至能在九个个体之间传递。有趣的是，这种细菌在人工培养基上不会发光，但在甲壳动物体内生长时则会发光，而这些甲壳动物大约会在七天后因感染而死亡。如果不对它们进行仔细研究，Talitrus和Orchestia这两个物种很可能会被误认为是真正的发光动物。

塔尔查诺夫（1901年）将发光细菌注入青蛙的背侧淋巴囊中，结果这些青蛙会持续发光三到四天，尤其是舌头部位。我记得有一次在古巴采集发光甲虫时，惊讶地发现了一只会发光的青蛙。由于认为这种动物极具研究价值，我对其进行了进一步观察，结果发现这只青蛙刚刚吃下大量萤火虫，萤火虫的光线从它的腹部透出，亮度相当高。

任何死亡的海洋动物都很容易被发光细菌感染，因为其肉体是极佳的培养基。我曾见过刚被捕杀的非发光鱿鱼，其体表布满了分布均匀的微小菌落，这与那些光仅来自体表散布的光器官的发光物种极为相似。

皮埃兰托尼（1918年）还将这一观点推到了极致。他认为，在萤火虫、头足类动物以及Pyrosoma的发光器官中存在着能够产生光的共生发光细菌，而且他声称已经在人工培养基上成功分离出了这类细菌。在萤火虫体内虽然可以观察到这类细菌，但却无法将其培养出来；而在那些体表没有可见细菌结构的发光动物身上，他认为存在类似过滤性病毒中所怀疑的那种超微小的发光细菌。尽管假设存在超微小生物会使反驳皮埃兰托尼的观点变得困难，但没人能否认：即便是超微小的生物，经过20%重量的盐酸处理6小时后也会被杀死。不过，正如我们将会看到的那样，介形类甲壳动物Cypridina的发光物质能够承受如此长时间的强酸煮沸。至少有一只动物的发光现象，我相信还有许多其他动物的发光现象，都不可能是由某种共生生物产生的。

除了那些确实能发光但并非由动物自身产生的情况之外，还有许多生物的体表结构会产生干涉色。鸟类和蝴蝶的羽毛与鳞片往往具有虹彩光泽，很多情况下都属于这种情况。其中一些生物曾被误认为是会发光的。在水生动物中，最著名的例子当属生活在海面的海洋桡足类动物Sapphirina，它也很容易被捕获。

还有其他一些会发光的生物。它们的表皮上布满了细小的纹路，这些纹路能够使光线发生折射，从而在它们移动时发出闪光，就像火欧泊一样。显然，在完全黑暗的房间里，这类生物不会发出任何光亮。

人们常常认为猫或其他动物的眼睛也会发光。飞蛾在飞过火焰时，其眼睛也会像火珠一样发光。不过，这两种现象其实都属于反射现象，都是因为外部光源的光线进入眼睛后又被反射出来的结果。1810年，普雷沃斯特给出了正确的解释：在绝对黑暗的环境中，任何动物的眼睛都是看不见的。同样的道理也适用于生活在光线昏暗处的苔藓——裂叶苔，它的细胞几乎呈球形，结构类似透镜，能够使光线发生折射并聚焦在细胞底部的叶绿体上。部分光线会从细胞中反射出来，从而产生自发光的错觉。另一种具有类似自发光特性的生物是罗萨诺夫色藻，其自发光也是由于几乎呈球形的细胞所导致的反射作用。

此外，还有一些与生物体无关的光现象。其中最常见的是圣埃尔摩之火（英国水手们称之为“corposants”），这是一种在电荷缓慢释放时出现的发光现象，通常会出现在船桅、教堂尖顶甚至人的手指上。这种现象在冬季雪暴期间或之后最为明显，属于纯粹的电气现象。

另一种不太为人所知的发光现象是幽灵火，它出现在沼泽和死水池塘上，呈现为淡蓝色的火焰，可能静止不动，也可能移动，持续燃烧或时隐时现。由于这种现象极为罕见，其成因至今仍不清楚，但人们认为它是由沼泽中有机物质分解产生的自燃性气体磷化氢（PH3 + P2H4）所引起的。不过，磷化氢并非已知的有机物质分解产物，这一解释存在缺陷。甲烷（CH4）则是众所周知的有机物质分解产物，在沼泽中大量存在，它燃烧时也会产生淡蓝色火焰，因此有人认为幽灵火就是由甲烷产生的。但由于甲烷本身并不具备自燃性，因此仍然无法解释它是如何被点燃的。尽管这一现象仍然是个谜，但它也有可能是……

其起源可能与电有关，或者在某些情况下可以观察到大量发光的真菌聚集在一起。那些呈红色或橙色的花朵，比如罂粟花，在黄昏时分会发出闪光现象，这一现象完全是主观感受——因为眼睛在部分适应黑暗的状态下会产生残像。这一现象最早是由林奈的女儿观察到的，它只会在光线较暗的环境中、或者以侧视的方式观察植物时出现，而在完全黑暗的环境中或直接注视时则不会出现。也有与人类相关的发光现象记录在案（参见Heller，1854年的研究）。在无菌手术技术出现之前，伤口常常会被发光细菌感染，从而在夜间发亮。一些老外科医生甚至认为，发光的伤口比不发光的伤口更容易愈合。我们知道，发光细菌属于非致病性、无害的生物，它们即便存在于死鱼或肉体上，也总是出现在腐烂过程之前，而不会伴随腐烂现象的发生。根据罗伯特·波义耳的记载，食用发光的肉类并不会造成危害，除非该肉类同时也被致病菌感染了。还有少数案例显示，某些人的皮肤是光线的来源，尤其是当他们大量出汗时。这很可能是由于汗液中的物质堆积为发光细菌提供了养分，从而使它们得以生存。在早期的文献中也有尿液发光的记录，即刚排出的尿液会发出光芒。如果这些观察结果属实的话——当然也有可能存在疑问——那么目前我们还无法确定这种发光现象的成因。虽然发光细菌是强需氧生物，无法在厌氧环境中生存，但膀胱受到细菌感染的可能性还是存在的。根据我的实验，发光细菌可以在正常人的尿液中存活，但存活状况不佳；而在含白蛋白的尿液中，它们很可能能够更好地存活，因此那些被记录下来的尿液发光现象很可能是由发光细菌感染引起的。另一方面，这种发光现象也可能纯粹是化学作用的结果，比如某种化合物氧化后产生的异常、未完全氧化的代谢产物在空气中自发氧化所致。我们已知……

有时会出现代谢异常，比如在黑尿病中，同型半胱氨酸会随尿液排出，接触空气后会迅速氧化成深棕色物质。不过，目前尚未有报道表明同型半胱氨酸的氧化过程会伴随光线的产生，而某些其他有机化合物的氧化过程则确实会有光线出现。（详见第二章。）
最后，我们可以探讨人类在多大程度上可以利用发光生物。如果不考虑西印度群岛和南美洲的土著人将热带萤火虫用作装饰品，以及班达岛民将某种鱼类特有的发光器官用作钓鱼饵料的情况，那么可以发现发光细菌在实验室中具有多种用途。
这些方法都是贝杰林克在1889年和1902年提出的。例如，他利用发光细菌来检测过滤器是否完好——如果过滤器存在裂缝，细菌就会透过过滤器，从而产生发光的滤液；而完美的过滤器则不会让任何微生物通过，因此滤液为无色。发光细菌对氧气也非常敏感，缺乏氧气时就会停止发光。通过在黑暗环境中将发光细菌与三叶草叶片中的叶绿体乳剂混合，让细菌耗尽其中的氧气，然后再用不同颜色的光照射该混合物，就可以研究不同波长的光对光合作用的影响。只有当叶绿体接触到能够分解二氧化碳并释放氧气的光谱颜色时，细菌才会发光；而一旦这些氧气被细菌消耗殆尽，试管又会变暗。贝杰林克还基于一种名为荧光光杆菌的细菌只有在存在麦芽糖或能将淀粉转化为麦芽糖的酶时才会发光这一特性，开发出了利用发光细菌检测麦芽糖及淀粉酶的方法。尽管杜布瓦和莫利施都制造出了“细菌灯”，而且也有人认为这种照明方式在无法使用火焰的场合可能很有用，但至少可以说，发光细菌能否真正用于照明还是个疑问。或许其他类型的生物可以被利用，但细菌产生的光强度实在太弱，无法满足实际应用需求。科学史

它告诉我们，绝不要说任何事情都是不可能的。虽然很难有哪种发光动物能够被用来实际照明，但并没有理由我们不能学会萤火虫的发光原理。那样一来，我们或许还能更进一步，创造出效率更高的光源。关于我们对“萤火虫之谜”的探索取得了多大的成果，可以从接下来的内容中了解。

第二章 发光与炽热现象
现代物理理论认为，光是由振动的电子在以太中产生的连续波脉冲。我们最熟悉的那些光——阳光、电灯光、煤气灯光等——都是由于与光源的高温有着直接或间接关系的电学现象所产生的。所有温度高于绝对零度的固体都会在真空中发出波长（λ）和频率（ν）各不相同的波动，但这些波的传播速度（υ）是相同的，为每秒180,000英里，即300,000公里。实际上，υ是一个常数，等于λν，因此只需指定波长即可描述这些波。这就是辐射能或辐射通量。

众所周知，温度相对较低的物体所发出的长波会带来温暖感。随着温度的升高，除了这些长波之外，还会发出越来越多波长越来越短的波，其数量多到足以被察觉。在525摄氏度时，波长约为0.76微米的射线会以微弱的红色光芒呈现出来。随着温度继续上升，更短波长的光也会显现出来，光的颜色随之变为深红色（700摄氏度）、樱桃红（900摄氏度）、深黄色（1100摄氏度）、亮黄色（1200摄氏度）、白热态（1300摄氏度）以及蓝白色（1400摄氏度及以上）。当波长小于0.4微米时，这些光就无法再被我们的眼睛感知了；尽管它们能引发化学变化，但我们没有相应的感官器官来察觉它们。因此，处于白热状态的物体会释放出多种不同波长的辐射能或辐射通量，这些就是我们所熟知的“热、光和紫外线”。利用适当的棱镜，可以将这些光分散开来，形成连续的光谱，如图1所示。波长在0.76微米到0.4微米之间的辐射能，因其能够产生视觉效果，被称为可见辐射或光通量。在红外线之下还有一个尚未被研究的波长范围，而在那个范围之外，则可能是赫兹电波中的长波。

在无线电报通信中使用的波长。在紫外线之外还有一个尚未被研究的区域，再往外则是波长极短的伦琴射线（X射线）和镭射线。除了日后可能需要探究这些射线是否由发光生物释放之外，我们无需过多关注它们。紫外线中波长最短的被称为舒曼射线和莱曼射线。相关数据见表2。

表2：各类辐射的波长
光的波长通常以埃为单位来表示。1微米等于0.001毫米，相当于1000毫微米；10,000埃相当于1/10米，或者10^-8厘米。波长的范围从10^6厘米到10^-9厘米不等。

赫兹电波的波长范围为12公里以上至0.16厘米。尚未被研究的区域为0.16厘米至310微米。红外线的波长范围为310微米至0.76微米。可见光的波长范围为7600埃至4000埃。紫外线的波长范围为4000埃至320埃。另一个尚未被研究的区域为320埃至12埃。X射线的波长范围为12埃至0.2埃。镭的γ射线的波长则小于或等于0.2埃。

图1：各种类型辐射构成的连续光谱示意图。
一个物体所发出的总辐射能量与其温度有关。对于理想的辐射体，也就是所谓的黑体，其总辐射能量与绝对温度T的四次方成正比（斯蒂芬-玻尔兹曼定律）。在不同波长下发出的辐射能量则有所不同。

虽然并不完全相同，但在某一特定波长（λmax）处发出的能量会比更长或更短的波长处的能量更大，这一情况还取决于温度。如果能够以某种方式截获这些不同波长的光，就可以用适当的仪器测量出它们各自的能量，进而绘制出光谱能量曲线，显示出整个光谱中的能量分布情况。图2展示了几条这样的曲线，可以看出，温度越高，最大能量值出现的波长就越偏向短波方向。实际上，对于黑体而言，有λmax×T=2890这一关系；在5000摄氏度时（大约相当于太阳的表面温度），λmax处于可见光光谱范围内。而在气体灯或电灯中，λmax则位于红外区域。这些光谱能量曲线所围成的面积代表了所发出的总能量，只要知道了这个数值以及可见光辐射曲线所围成的面积，就能很容易地判断出某种光源作为发光体的效率如何。我们将在第三章中进一步探讨这个问题，具体研究萤火虫作为光源的效率。

图2——太阳、电弧灯和气体灯的光谱能量分布
（源自Nichols和Franklin的研究）。纵轴表示不同波长下光的相对强度。曲线上的凹陷部分代表吸收带，而虚线则表示在没有选择性吸收的情况下太阳辐射应有的形态。V代表可见光光谱的紫色端，R代表红色端。
（图片由Macmillan Co.提供）

因为高温而发光的物体被称为白炽体，这种发光现象被称为热辐射。不过，我们也知道有许多物质在远低于此温度的情况下也会发光。

525摄氏度。这类物质并不遵循斯特藩-玻尔兹曼定律，其发光是由热以外的其他因素引发的。我们将这类物质称为发光体，所有会发光的动物都属于这一类别。维德曼在1888年首次指出了“光”与“发光”之间的区别。通常，人们会根据引发发光的手段将各种发光现象分为以下几类：

热致发光
磷光与荧光
光致发光
阴极发光
阳极发光
放射致发光
摩擦致发光与压电致发光
晶体致发光
化学发光

当电流通过真空管时所产生的发光现象有时被称为电致发光。由于电致发光以及热致发光实际上都是磷光或荧光的特殊形式，而摩擦致发光与晶体致发光则彼此密切相关，因此这种分类方式的意义仅在于强调发光的产生机制。让我们依次探讨每种发光类型，以便将动物的发光现象——即生物发光——归入其中某一类别。所有这些都属于“冷光”的范畴，也就是在远低于固体发光时所需温度条件下产生的光。本尼恩火焰中的盐类所发出的光也属于这一类别，因为火焰光谱及一般线光谱都只有在相对较高的温度下才能产生，不能与气体或蜡烛中碳颗粒因高温而产生的辐射相混淆。钠焰或锂焰等并非单纯由温度决定的现象，因此被归为一种发光现象，即热致发光。由于生物体的发光现象绝不可能属于在远高于生命存活所需温度下才发生的热致发光，因此这里就不讨论这种形式的发光现象了。此外，还有其他一些低温下的发光现象，比如在空气中存在的CS2所发出的光，尽管其温度相对较低，但其中含有大量紫外线。

这些现象对物理学家和化学家来说很有趣，但它们与动物的发光现象并无直接关系，因此也不予讨论。（参见Bancroft和Weiser，1914–1915年。）
热致发光——某些物质在温度远低于525°时就会开始发出波长比红色更短的光，这就是热致发光现象。钻石、大理石和萤石就是例子。只有某些种类的萤石才会明显表现出这种现象：将这类萤石的晶体放在铁勺上，用本生灯加热，早在铁勺出现红色痕迹之前，该晶体就会发出白光。其他晶体在热水中也可能发光。总体而言，这种发光现象依赖于晶体之前所受到的光照或辐射。如果将萤石置于100°的温度下并长时间置于黑暗中，就不会有光线产生；但若先让它暴露在白炽灯的光线下，尽管在室温下观察不到荧光，但在100°时却会出现明亮的亮光。含有微量硫酸锰的钙盐、钡盐、锶盐、镁盐等硫酸盐，在受到阴极射线照射后也会出现类似现象（Wiedemann和Schmidt，1895b）。这些物质在受到射线轰击时会发光，但一旦射线停止，发光现象也会立即消失。如果再对这些硫酸盐进行加热，它们就会发光——MgSO4 + MnSO4会发出红光，而CaSO4 + MnSO4则会产生绿光。在受到阴极射线照射后，这种发热发光的能力可以保持数月之久。物体在先前受到光照或辐射后仍能发光的现象被称为磷光，我们将在后面详细讨论。看来，我们所了解的热致发光现象实际上就是因温度升高而加剧的磷光现象。热致发光物质的光谱也与磷光物质的谱线相似。（见图3。）不过，并非所有的磷光材料都具有热致发光特性。动物的发光现象则与热致发光完全不同。
磷光与荧光——虽然“磷光”一词常被宽泛地用来指代各种发光现象，尤其是磷或发光动物的发光现象，但对物理学家而言，它有着明确的含义，即物质吸收了辐射能量后以光的形式将其释放出来。白磷发出的光并不属于磷光的范畴。如果辐射能量是光（可见光或紫外线），则称为光致发光；若是阴极射线……

我们有阴极发光现象，还有阳极射线带来的阳极发光现象；而当使用X射线时，则会出现辐射发光现象。由于镭的α、β和γ射线分别对应于阳极射线、阴极射线以及X射线，因此镭的辐射也能使多种材料发出光亮。如果某种材料仅在受到辐射时才发光，那就称为荧光；如果发光现象会持续存在，则称为磷光。这种区分或许纯属人为规定，因为有许多物质在受到光照后仅会发出几分之一秒的光（在某些情况下为1/5000秒），这属于光致发光现象。还有一些物质在常温下会发出荧光，但在低温下则会呈现磷光现象。磷光主要出现在固体中，而荧光则常见于液体和气体中。

要观察持续时间很短的磷光现象，必须使用特殊装置。E.贝克勒尔就设计了一种用于此目的的仪器——磷光镜。该仪器由带有孔洞的旋转圆盘组成，待检测的物体被放置在这些圆盘之间。这些孔洞的排列方式使得物体先被照亮，随后又完全与光线隔绝。观察者通过另一个孔洞观察物体，在其不再被照亮的瞬间就能看到它，从而判断其是否正在发出磷光。通过测定圆盘的旋转速度，就可以很容易地计算出磷光现象的持续时间。

在常温下，只有相对较少的固体在受到光照后会呈现磷光现象，但在液氮温度下，许多固体都会具备这一特性。这类物质包括尿素、水杨酸、淀粉、胶水以及蛋壳等生物产物。温度还会影响所发出光的波长，进而影响光的颜色。通常情况下，温度越高，波长越短；但对于某些物质（如SrS）来说，温度升高反而会导致波长变长。

在室温下最著名的磷光现象，也是人们通常所说的磷光现象的典型代表，就是碱土金属硫化物（BaS、CaS、SrS）以及ZnS所表现出的现象。据说意大利人维琴佐·卡斯卡里奥洛发现了博洛尼亚石（BaSO4），通过用木炭将其煅烧，可以得到不纯的磷光性物质BaS，也就是所谓的“太阳石”。坎顿磷矿（CaS）则是后来通过将三份经过煅烧的牡蛎壳粉末与一份……混合加热而制得的。

“将硫置于高温下加热一小时。”赫尔姆称其为“广州的轻质磁体”，因为它具有吸收和引导光线的能力。纯硫化物并不具备这种性质；只有当其中含有少量铜、铅、银、锌、锑、镍、铋或锰等金属时，硫化物才会发出荧光。百万分之一的杂质含量往往就足够了。这类混合物与Na2SO4、Li3(PO4)2或其他可熔盐一起，便构成了“荧光剂”。实际上，“荧光剂”就是一种固溶体的体现，也是某些发光涂料的基础。

荧光光的强度和持续时间主要取决于激发光的性质，而颜色则主要受其中杂质的影晌，不过碱土金属也会对其产生影响。温度升高会增强光的强度，但会缩短其持续时间，因此在不同温度下发出的总光量大致保持不变。

大多数荧光物质的光谱由一个或多个连续谱带组成，这些谱带的峰值位于不同的波长处。照射在荧光物质上的光中，也存在着一些会被吸收的光束，而这些光束的波长更有利于激发荧光。荧光光中的这些谱带通常比激发荧光的光的谱带波长更长。这一现象被称为斯托克斯定律，但实际上它并非普遍适用。有趣的是，红光和红外光能够在使荧光短暂增强之后使其熄灭，人们曾利用荧光材料来检测萤火虫的光是否包含红外光。艾夫斯（1910年）的研究表明，红外辐射并没有像对ZnS的荧光那样能够熄灭萤火虫的光，这一事实表明萤火虫的光并非由荧光作用产生的。图3为ZnS荧光光谱的照片复制品。

图3. 硫化锌的荧光光谱（源自Ives和Luckiesh的研究）。这些照片是通过特殊设备拍摄的，分别是在暴露于汞弧光后1分钟（中间）和15分钟（底部）时拍摄的，并与氦气光谱（顶部）进行了对比。在中间那张照片中，可以看见汞的激发线。值得注意的是，在荧光衰减过程中，那条狭窄的荧光带的位置并不会发生改变。其他研究结果表明，发光动物发出的光并非荧光，而且与之前是否受到光照毫无关系。即使将发光细菌在黑暗中培养数周，它们仍会继续发光。实际上，强光对这些细菌具有杀菌作用，其效果与对普通细菌的作用类似；而对于某些海洋生物来说，光线则具有抑制作用——它们在白天会失去发光能力，只有到了黄昏或再次处于黑暗环境中时才能重新发光。事实上，普通光线永远无法像使CaS发出荧光那样促使其他物质发光。荧光最容易被真空管中的阴极射线激发。这些射线不仅会使管内的残余气体发光（即电致发光），从而让人能够看到它们的路径，还会使管壁发出明亮的荧光，颜色为黄绿色。

含钠玻璃会发出蓝绿色光，而含铅和锂的玻璃则会产生蓝绿色光。当阴极射线穿过LiCl2时会产生蓝光，而穿过阳极射线时则会产生红光；NaCl在阴极射线作用下会发出蓝光，在阳极射线作用下则会产生黄光。后者的光谱为锂或钠的线状光谱，呈现出与在本生灯火焰中观察到的类似的红色或黄色线条。这些盐类在阴极射线激发下产生的光谱则是蓝色区域内的连续谱。一般来说，荧光光谱都具有这种特性，即由一个或多个区域内的短波长光带组成。

钻石、红宝石以及许多矿物在阴极射线照射下都会发出强烈的荧光。某些氟石（CaF2）样本的荧光现象尤为明显，因此才有了“荧光”这一名称。人们常常使用氰化铂钡、硅锌矿（Zn2SiO4）、硫化锌或钨酸钙等物质制成的荧光屏来使X射线可见。目前最常用的发光涂料是含有微量镭盐的硫化锌。镭不断释放出的射线会使硫化锌持续发光。实际上，如果用透镜观察手表表盘上的这种涂料，就能清楚地看到α粒子撞击硫化锌时产生的闪光，就像在旋光镜中看到的那样。

一些动物组织及体液，尤其是眼睛的晶状体，在镭射线照射下也会发光，Exner在1903年进行的实验就证明了这一点，不过并没有证据表明具有发光能力的动物在这方面特别活跃。紫外线也有类似的作用。

几乎所有能够发光的物质，只要被足够快速地干燥处理，就可以变成干粉形式，这种干粉遇水后会发光。Coblentz在1912年将这种干粉暴露在光线、紫外线火花以及X射线下，但从未观察到任何磷光或荧光现象。我曾研究过镭对Cypridina发光物质的影响：20毫克的镭（很可能是其溴化物）并未对该发光溶液产生增强或减弱作用，而且在该动物的非发光提取物中也没有引发磷光或荧光。因此我们可以得出结论：动物的发光现象并非由动物自身产生的辐射所引发的某种物质的荧光效应。

许多物质在强光下会发出荧光。硫酸奎宁、矿物油、伊红、荧光素、七叶树苷、罗丹明、叶绿素等物质的这种现象尤为明显。当伊红的浓度为10^-8克/立方厘米时，其在日光下就能发出荧光；而浓度达到10^-15克/立方厘米时，则在弧光灯照射下也会发光。人们往往难以意识到，硫酸奎宁所呈现的蓝色荧光实际上是一种光的发射，而非反射。不过，如果将装有硫酸奎宁溶液的试管置于紫外光区域，它仍会发出淡蓝色的光，即便没有可见光照射它。关于这一点，被誉为“荧光”一词的发明者以及我们目前对这一现象的大部分认知的来源——斯托克斯这样说道：“当把装有硫酸奎宁溶液的试管放入不可见光中时，它会立刻亮起来，这真是一幅奇妙的景象；简直可以说是‘黑暗也能被看见’。”硫酸奎宁能够吸收紫外线，并将其转化为可见的蓝光。它的光谱是连续的短波段光谱。大多数荧光物质都会将短波长光转化为长波长光（遵循斯托克斯定律），但也有一些物质可能会产生相反的效果。

在少数会发光的动物体内也发现了具有荧光特性的物质，尤其是几种萤火虫，以及一种不会发光的甲虫。这类物质被称为火光素或荧光素。杜布瓦在1886年认为火光素具有吸收不可见光并将其转化为可见光的能力，从而帮助动物发光。但科布伦茨在1909年的研究证明了事实并非如此。他拍摄了萤火虫发出的光的光谱以及荧光素的光谱，结果发现后者的光谱几乎与前者互补（见图4），而在萤火虫发出的光的光谱中则完全看不到荧光素的光谱特征。麦克德莫特在1911年研究了荧光素的性质，认为它只是存在于许多萤科动物体内的偶然存在的物质，与生物发光过程并无关联。通常，少量碱类会增强溶液的荧光强度，而酸类则会抑制其荧光作用。

图4——下方为萤火虫中含有的荧光物质的光谱（2），上方为萤火虫发光的光谱（2），二者均与氦气真空管（1）的光谱进行了比较（数据来自Coblentz）。
摩擦发光与压电发光——这一类别包含了多种看似属于电学现象的发光现象，但实际上并非如此。这类光是由晶体的摇晃、摩擦或挤压产生的，只有晶体才会表现出摩擦发光或压电发光现象。硝酸铀就是一个典型的例子：轻轻摇晃这些晶体就会产生光点，这些光点很类似于含有甲藻的海水被搅动时所产生的闪光。如果将罗姆伯格磷——即熔融状态的CaCl2——在袖子上摩擦，它也会发出绿色光芒。甘蔗糖块相互摩擦也会发光。糖精晶体在受到摇晃时也会发光，Pope在1899年发现，糖精发出的蓝光强度足以在白天的房间里被看到。这种光仅出现在不纯的晶体以及新结晶的样品中。此外，还有其他晶体在一段时间后也会失去发光能力。

在生物物质中，蔗糖、乳糖、甘露糖、马尿酸、天冬酰胺、R-酒石酸、L-苹果酸、香兰素、可卡因、阿托品、苯甲酸以及许多其他物质都具有摩擦发光现象。Tschugaeff（1901年）、Trautz（1905年）和Gernez（1905年）都列出了大量的此类物质。其发出的光为连续的短波段，具体波长取决于晶体的种类，因此不同桑托宁衍生物发出的光色从黄色到绿色不等，而糖精则发出蓝色光。尽管某些生物体产生的光与摩擦发光现象类似——通过摩擦或摇晃这些生物体就能产生光——但实际上两者存在本质区别，因为生物体产生的光依赖于氧气的存在，而摩擦发光则不需要氧气。

晶体发光现象——当溶液结晶时会出现晶体发光现象。Bandrowski在1894年和1895年对氧化砷、NaF以及向热饱和NaCl溶液中加入HCl或酒精时的情况进行了描述，此时会出现带有闪光点的蓝光。所有经过验证的案例都涉及简单的无机盐，而这些物质也都具有摩擦发光特性。不过，反过来则不成立：许多具有摩擦发光特性的物质并不具备晶体发光特性。晶体发光现象的分布范围远小于摩擦发光现象。Trautz在多种化合物中研究了这一现象，他认为这种光实际上是摩擦发光现象的一种特殊形式，即单个晶体的生长导致它们相互摩擦而产生光。对于那些具有晶体发光特性的晶体来说，搅拌后会发出更明亮的光。虽然在某些情况下，晶体发光确实是由于晶体相互摩擦产生的，但并非在所有情况下都是如此，Weiser在1918年的研究就清楚地证明了这一点。他研究了在向饱和碱金属卤化物水溶液（如NaCl、KCl等）中加入酒精或HCl后所出现的发光现象。在这种条件下，盐分会结晶出来，Weiser发现，当酒精或HCl的浓度足以使Na离子和Cl离子聚集在一起时，发出的光最为明亮。他认为，出现的蓝光是由于Na+ + Cl- = NaCl这一反应中离子的结合所导致的。只有当这一反应足够快速地发生时，才会出现发光现象。Weiser还研究了AsCl3和K2SO4的晶体发光现象与摩擦发光现象，他通过彩色摄影的方式记录了这些发光现象。

具有不同吸收能力的屏幕（Weiser，1918，a）可用于获取光谱，结果发现摩擦发光与晶体发光的光谱是相同的；对于AsCl3而言，其光谱中存在绿蓝色、蓝色和紫色波段的谱带。Weiser认为，在这种情况下，光线也是由离子重新结合产生的，即As+++ + 3Cl- = AsCl3；而总体而言，晶体发光是由于通过电解作用分解后的离子迅速重新形成分子所导致的，而摩擦发光则是由于晶体受到剧烈破坏后离子迅速重新形成分子所引起的。当然，对于那些不会分解成离子的有机晶体来说，产生光线的必定是其他某种反应。有一点是肯定的，即这两种发光现象之间存在相似性。正如Bigelow[1]所说：“很有可能，这种（晶体发光）现象的成因，无论是什么，都与摩擦发光的成因相同。”[1]《理论与物理化学》，1912年，第516页。

除了萤火虫之外，动物的发光器官中并不存在晶体。在萤火虫体内，有一层细胞（见第四章），其中含有嘌呤类物质——黄嘌呤或尿酸的微小晶体。人们可能会推测，萤火虫发出的光就是这些晶体形成过程中产生的晶体发光现象。然而，很容易证明，光线并非来自晶体层，而是来自另一层含有大颗粒的细胞。此外，萤火虫的发光需要氧气的存在，而晶体发光则可以在无氧环境中发生。晶体层或许起到了反射器的作用，其具体功能将在后面的章节中讨论。

图5——杜布瓦的图示，展示了感光颗粒向晶体的转化过程（引自杜布瓦）。
发光生物发出的光通常与某些颗粒有关。在一种能够分泌发光物质的马陆（Orya barbarica）中，杜布瓦在1893年描述了这些颗粒向晶体的转化过程；他曾认为这种光是一种晶体发光现象。后来他改变了这一观点，而图5中所展示的他的绘图显然无法证明晶体确实形成了。
维德曼和施密特在1895年描述的溶胶发光现象，指的是当含有锂、钠或钾氯化物的彩色晶体在阴极射线作用下溶解时所伴随的光亮，这种现象很可能是由于晶体在溶解过程中受到搅动而产生的摩擦发光所致。
化学发光——顾名思义，化学发光是指在低温条件下通过化学反应产生光的现象。

这并不意味着其他类型的发光现象与化学反应无关——此处所说的“反应”应理解为广义上的反应——因为我们有理由相信，在某些情况下，光谱并非该元素本身的特征，而是该元素参与某种特定反应时的特征（如分解为离子、从一价态变为二价态等），而这正是同一元素在不同条件下会呈现不同光谱的原因（Bancroft，1913）。化学发光实际上属于氧化反应，涉及对气态或溶解氧的吸收，根据这一标准可以很容易地将它与前述所有发光现象区分开来。或许更恰当的名称应是“氧化发光”。磷的发光现象是最为人熟知的例子，自1669年Brandt首次制备出磷以来人们就已知其具有这种特性。有趣的是，最初人们认为磷是一种特别持久的荧光物质，即类似于不纯的碱土金属硫化物。新鲜切割的钠和钾金属表面在黑暗中会持续发光一段时间，尤其是当温度达到60°-70°时（Linnemann，1858）。这些金属表面会形成一层氧化物，这显然表明发生了氧化反应。臭氧在氧化有机物的同时也会产生发光现象（Fahrig，1890；Otto，1896）。在特定条件下，臭氧作用于邻苯二酚溶液时产生的光尤为明亮。Radziszewski（1877，1880）列出了大量在碱性酒精溶液中缓慢氧化后会发光的物质，其中主要是各种精油。甲醛、二氧甲基乙烷、副醛、金属醛、丙烯醛、二丙烯酸、醛氨、丙烯酰胺、氢化苯甲酰胺、洛芬、氢化茴香酰胺、茴香胺、氢化肉桂酰胺、肉桂酰胺，以及蜡类，还有葡萄糖、卵磷脂、胆固醇、胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸等生物物质，以及脑苷脂，所有这些物质在氧化后都会发光。Radziszewski本人以及许多其他学者都将生物体发出的光与这类发光现象相提并论。事实上，几乎所有能发光的组织细胞中的颗粒都被误认为是油滴，这一错误认知在很大程度上源于Radziszewski的研究成果。Dubois（1901 b）又加入了七叶树素，而Trautz（1904-5）则将多种醛类和酚类衍生物，包括香兰素、罂粟碱、单宁酸和没食子酸，以及甘油和甘露糖，也列入了会发生氧化反应的生物物质列表中。

会产生光。Guinchant（1905年）描述了尿酸和天冬酰胺的氧化发光现象；Weitlaner（1911年）研究了腐殖质中的物质；McDermott（1913年）则研究了尿液以及胶水与Witte蛋白胨在厌氧碱性条件下的水解产物。邻苯二酚尤其容易发光，这一现象最早是由Lenard和Wolf（1888年）在使用邻苯二酚作为显影剂处理照相底片时发现的。后来，Trautz和Schloringin（1904–1905年）对这种发光现象进行了较为详细的研究，他们还制备出了由邻苯二酚、甲醛、K2CO3和H2O2组成的著名发光混合物。正如我所展示的，邻苯二酚可以通过多种不同的方式被氧化，其中一些氧化方式极具研究价值，因为它们与生物体内产生光的机制极为相似。这些氧化方式记录在表3中，表中还列出了其他具有普遍或生物学意义的氧化发光反应类型。

表3 氧化发光反应的类型

1. 在空气中自发氧化。
(a) 在常温下。[磷、新鲜切割的钠或钾表面、硫光气及硫醚类物质（RCS·OR）。]
(b) 在熔点或沸点下。（脂肪、萜烯、糖类、树脂、树胶、乙醚、丝绸等。）
2. 在碱性水溶液或酒精溶液中氧化。（许多有机物质。）
3. 在次碘酸盐、次溴酸盐或次氯酸盐中氧化。（许多有机物质。）
4. 在过氧化物（H2O2或Na2O2）中氧化。（许多有机物质。）
5. 在臭氧中氧化。（许多有机物质。）
6. 在酸性高锰酸钾中氧化。（邻苯二酚。）
7. 在过硫酸盐和过硼酸盐中氧化。（甲醛、多聚甲醛。）
8. 在高氯酸盐、高碘酸盐和过溴酸盐中氧化。（棕榈酸。）
9. 2与4的结合反应。（许多有机物质。）
10. 3与4的结合反应。（许多有机物质。）

11. 用H2O2以及血红蛋白或植物氧化酶进行氧化反应。（如焦性没食子酸、没食子酸、洛芬、七叶皂苷等。）
12. 用H2O2以及MnO2、Fe2Fe(CN)6、Mn(OH)2、Mn(OH)3、Ag2O、氧化铬、氧化钴进行氧化反应。（如焦性没食子酸。）
13. 用H2O2以及亚铁氰化物、铬酸盐、重铬酸盐、高锰酸盐、铁盐和铬盐进行氧化反应。（如焦性没食子酸、七叶皂苷等。）
14. 用H2O2以及胶体银、铂、钯、金进行氧化反应。（如焦性没食子酸。）

已有少数研究描述了化学发光反应的谱线为连续谱，但尚未有对其范围的具体测量数据。Radziszewski（1880年）发现，在碱性酒精环境中被氧化后的洛芬经双棱镜分光镜观察时会产生连续谱，最亮处位于E位置，而红色与紫色端则不存在。Trautz（1905年，第101页）指出，焦性没食子酸-甲醛-Na2CO3-H2O2反应会产生从红色到蓝绿色的连续谱，其中橙色区域亮度最高。Weiser（1918a年）通过拍摄一系列彩色滤光片后的光线来研究某些化学发光反应的谱线，他发现这些谱线较短，且在不同区域亮度达到最大值。例如，被氯或溴氧化后的阿马林产生的光谱从黄色延伸到绿蓝色，绿色区域亮度最高；而溶解在冰醋酸中并经过H2O2氧化的磷则会产生从黄绿色到紫色的荧光。

发光动物的光谱与化学发光反应的光谱极为相似。此外，正如我们所见，化学发光本质上属于氧依赖型发光，因为该反应需要氧气。所有发光动物也需要氧气才能产生光。因此，生物发光与化学发光属于类似的现象，它们与我们所研究的其它所有形式的发光都有所不同。发光动物发出的光是由其细胞内某种物质被氧化所产生的，如果我们能够写出这种发光物质的结构式，并了解其氧化过程，那么动物发光的机制问题就能得到解决。

第三章 动物光线的物理特性
从物理角度研究动物发出的光线时，人们关注的焦点主要是其质量、效率及强度等问题。不过，只有在甲虫这一类发光动物身上，才有人对这些特性进行了精确的测量。这部分是因为这类动物数量众多且能引起人们的兴趣，另一方面也是因为它们属于最明亮的发光生物之一。微弱的光线不仅难以测量，而且当其被分解为光谱后，所产生的谱带极为暗淡，其边界很难辨认，更不用说拍摄了。很少有生物能够发出完全适应光照的眼睛所能看到的光线。虽然对于适应黑暗的眼睛来说，这些光线可能看起来相当明亮，但这种眼睛却无法准确判断光线的质量，也就是颜色。这是因为存在普金耶现象——即随着光线强度的变化，视网膜上感光最强的区域也会发生变化。对于具有相同能量分布的光线而言，在完全适应光照的正常眼睛看来，波长为λ=0.565微米的黄绿色光线最为明亮；但随着光线变弱，感光最强区域会先转向绿色，然后再转向蓝色。适应黑暗的眼睛对绿色或蓝色的感知能力优于黄色，因此，相同能量分布的微弱光线会比较强的光线呈现出更多的绿色或蓝色色调。此外，如果两束具有相同光谱成分的微弱光线的强度差异很大，它们的颜色也可能有所不同。图6便展示了这一现象。

图6——三种照明条件下的可见度曲线，显示了最大可见区域的变化情况，即普金耶现象（引自Nutting）。在0.5到50米烛光强度的照明条件下，人眼的敏感度会发生变化，这种变化表现为从中央视锥细胞视觉（高亮度环境）向周边视杆细胞视觉（低亮度环境）的转变。中央凹没有视杆细胞，因此在极低光照强度下，该区域几乎丧失色觉功能。在0.5米烛光以下及50米烛光以上的强度范围内，可见度随光照强度的变化而产生的波动很小。由此可见，有必要区分光的物理客观现象与人对光的主观感受。事实上，不同的发光生物所发出的光颜色各异，根据人眼观察，这些光的光谱色调从红色到紫色不等，不过“黄褐色”、“绿褐色”和“蓝褐色”最为常见。确实有一些生物拥有多个能够发出不同颜色光的发光器官：例如南美洲的萤火虫Phengodes，其发出的光为红色和绿黄色；而深海乌贼Thaumatolampas diadema则能发出三种颜色的光，即两种蓝色和红色。乌贼发出的红色光似乎是由于色素细胞形成的红色滤光层所致，而Phengodes则没有这样的滤光层。

表4 线光谱中弗劳恩霍夫线与显著线的波长

弗劳恩霍夫线

线条颜色 波长（µµ = µ/1000） 来源
A 红色 759.4（谱带）大气中的氧气。
a 红色 718.5（谱带）大气中的水蒸气。
B 红色 686.7 大气中的氧蒸气。
C 红色 656.3 太阳中的氢。
D1 D2 黄色 589.6、589.0 太阳中的钠。
E 绿色 527.0 太阳中的钙。
b1 b2 b4 绿色 518.4、517.3、516.8 太阳中的镁。
F 蓝色 486.1 太阳中的氢。
G 紫色 430.8 太阳中的钙。
H K 紫色 396.9、393.4 太阳中的钙。

本生火焰线

来源 颜色 波长（µµ = µ/1000）
钾 红色 769.9、766.5（双线）
锂 红色 670.8
钠 黄色 589.6、589.0（双线）
铊 绿色 535.1
镁 绿色 518.4
锶 蓝色 460.7

普吕克管线

来源 颜色 波长（µµ = µ/1000）
汞 黄色 579.0、576.9
绿色 546.1
蓝色 491.6、435.8
紫色 407.8、404.7
氢 红色 656.3

蓝色：486.1、434.1
氦红色：728.2、706.5、667.8
黄色：587.6
绿色：504.8、501.6、492.2
蓝色：471.3、447.2
紫色：438.8、402.6、388.8

正如我们所见，由于普尔金耶效应的存在，光色的差异并不一定意味着光谱成分的差异。不过，通过对各种发光生物的光谱进行分析后可以明确看出，不同的颜色实际上是由不同波长的光线造成的，而非某种主观现象的结果。为便于比较，表4列出了各光谱线及其对应的颜色。最早对发光动物光谱进行系统研究的是巴斯德（1864年），他研究了火萤，发现其光谱为连续的，没有明暗带。兰克斯特（1868年）在另一种发光生物中也发现了类似的连续光谱，并将其范围定在索比刻度上的5号线到10号线之间（大约对应λ = 0.55µ至λ = 0.44µ）。杨（1870年）首次记录了火萤光谱的范围，为C线（λ = 0.6563µ）稍上方到F线（λ = 0.4861µ）。此后，许多其他发光生物也被研究过，结果发现它们的光谱均为连续的，且没有明暗带或线条，只是位于不同的颜色区域。康罗伊（1882年）研究了萤火虫的光，发现其光谱范围为λ = 0.518µ至λ = 0.656µ。杜布瓦（1886年）指出，西印度地区的“库库洛”火萤的光谱范围是从弗劳恩霍夫B线稍外侧一直延伸到F线；而兰利和韦里（1890年）对同一种生物的研究则将光谱范围定在λ = 0.468µ至λ = 0.640µ之间。因此，这种火萤的光谱主要属于绿色和黄色范围。不过，“如果它的光足够亮，能否延伸得更远呢？……如果这种昆虫的光亮度和太阳光一样，那么它的光谱是否也能向两侧延伸同样的距离呢？”“通过任何光学装置都无法提高光的内在亮度，但虽然无法让昆虫的光达到太阳光的亮度，却完全可以让太阳光的不亮度与昆虫的光相当……”兰利和韦里对这个问题进行了研究，他们利用与火萤光强度相同的阳光制作出了太阳光谱，同时还将火萤的光谱也绘制在同一图象中。

分光镜。后者的光谱长度远远短于太阳光谱，这说明其较短的长度并非因为红光和蓝光强度较弱，而是因为这两种光根本不存在。后来，艾夫斯和科布伦茨在1910年使用能够感知所有可见光波长的感光板，拍摄了萤火虫（Photinus pyralis）以及碳发光灯的光谱，在这样的条件下应该可以记录下所有发出的可见光辐射。他们发现这些光谱的波长范围仅为λ = 0.51µ至λ = 0.67µ（见图7）。科布伦茨在1912年又发现另一种萤火虫（Photuris pennsylvanica）的光谱波长范围为λ = 0.51µ至λ = 0.59µ（见图8）。而Photinus属萤火虫发出的光则延伸到更红的波段，因此只需通过其光的红色调，就能轻易区分Photinus属与Photuris属萤火虫。这些照片记录清楚地表明，发光动物所发光线的颜色并非由普金耶效应或光线强度过低所导致的主观现象，而是真实存在的，即它们发出的光在光谱组成上确实存在差异。至少在所研究的萤火虫中，这种颜色差异也不是由于存在某种能吸收某些光线、只让特定颜色的光线通过的色屏所造成的。目前所研究过的各种生物的光谱如图9所示，并记录在表5中。可以看出，虽然这些光谱的峰值位置差异很大，但都属于同一类型。Cypridina hilgendorfii的光谱是迄今为止研究过的中最长的（λ = 0.610µ至λ = 0.415µ），其光谱延伸到了蓝色波段，因此这种生物发出的光呈现出明显的蓝色。

图7——碳发光灯A、萤火虫（Photinus pyralis）B以及氦真空管C的光谱（数据来自艾夫斯和科布伦茨）。

图8——氦气真空管（1）、碳丝发光灯（2）、萤火虫Photinus pyralis（3）以及萤火虫Photuris pennsylvanica（4）的光谱（根据Coblentz的资料）。

图9——各种发光动物的光谱
（引自McDermott）。1. 显示弗劳恩霍夫线的太阳可见光光谱片段。2. Pyrophorus noctilucus（Langley和Very研究）。3. Lampyris noctiluca（Conroy研究）。4. Photinus pyralis（Ives和Coblentz研究）。5. Photinus consanguineus（Coblentz研究）。6. Photuris pennsylvanica（Coblentz研究）。7. Phengodes laticollis（McDermott研究）。8. 发光细菌，即B. phosphorescens或Bacillus photogenus（Molish研究）。9. Photobacterium indicum（Barnard研究）。10. X型菌丝体（Molish研究）。11. 发光细菌（Förster研究）。12. Agaricus属真菌？（Ludwig研究）。13. Photinus pyralis中荧光素的光谱（Coblentz研究）。仅显示了光谱带的末端部分，未展示完整光谱。

用于表示光谱中不同部分的相对密度。

表5——各种发光生物的光谱范围

发射方式与光谱（微米），观察者及最大值相关说明：
Cypridina Harvey：通过肉眼观察，光谱范围为0.610-0.415；1919年由Zeiss公司使用分光镜进行比较研究。
Chætopterus insignis：通过肉眼观察，光谱范围约为0.55-0.44；1868年由Lancaster进行研究。
Pyrophorus dubois：通过肉眼观察，光谱范围为0.72-0.486；1886年由Noctilucus进行研究。
Pyrophorus noctilucus：通过肉眼观察，其胸部发光部分的光谱范围为0.640-0.468，腹部发光部分的光谱范围为0.57；1890年由Langley与Noctilucus的光谱进行比较，两者强度相当。
Pyrophorus noctilucus的腹部发光部分的光谱范围为0.663-0.463；1909年由Ives使用碳光灯进行比较研究，结果与Noctilucus的光谱强度相当。
Photinus pennsylvanica：1912年由Coblentz使用碳光灯进行比较研究，其光谱范围为0.59-0.51；1912年由Coblentz再次使用碳光灯对其与Photinus consanguineus的光谱进行比较，两者强度相当。
Photinus consanguineus：1912年由Coblentz通过摄影方式对其光谱进行研究。

碳光灯，发光强度相同。
Phengodes McDermott，观测值在0.65至0.52之间。
Laticollis 1911 e，观测值在0.656至0.518之间。
Lampyris Conroy，观测值在0.656至0.518之间。
（萤火虫），1910年，通过肉眼观测。
Young，Photinus的观测值在0.670至0.487之间，1870年通过分光镜进行观测。
从G到F，Barnard的观测结果；1902年通过长曝光法进行拍摄，Fisher也进行了相关观测。
从G到D，1888年通过肉眼观测，Förster与Zeiss的Abbe仪器也用于观测，观测值在0.58至0.43之间。
1887年通过微分光镜进行观测，结果为0.58至0.43。
Forsyth的观测值大于0.500，至0.350之间，1910年通过石英分光镜进行观测，同样通过肉眼观测。
Agarious的观测值在0.56至0.48之间，Ludwig在1884年使用微分光镜进行观测。
Xylaria的观测值在0.54至0.46之间，同样由Ludwig在1884年使用微分光镜进行观测。
Micrococcus的观测值在0.54至0.46之间，由Ludwig在1884年使用微分光镜进行观测。
Molish的观测值在0.570至0.480之间，1904年通过Zeiss分光镜进行比较研究。
某种细菌的观测值在0.570至0.450之间，1904年通过Zeiss分光镜进行比较研究。

分光镜；目视观察；莫利施细菌；0.570 – 0.450的蔡司光谱对比数据；1904年出版的相关书籍；分光镜；目视观察；莫利施芽孢杆菌；0.570 – 0.450的蔡司光谱对比数据；1904年出版的相关书籍；分光镜；目视观察；莫利施假单胞菌；0.570 – 0.450的蔡司光谱对比数据；1904年出版的相关书籍；分光镜。

正如杜布瓦在1886年对火萤所进行的实验所示，后来我也通过实验在鲤鱼藻身上验证了这一点：这类生物发出的光并非具有任何偏振性。需要补充的是，与其它光线一样，鲤鱼藻发出的光在通过尼科尔棱镜后也会出现偏振现象。多位学者——包括杜布瓦（1914年的著作）、费舍尔（1888年）以及莫利施（1904年的著作）——都注意到，发光细菌在不同培养基上生长时，其发出的光颜色会发生变化。在死鱼身上呈现“银白色”的光，在盐蛋白明胶培养基上会变成“绿色”，而在低盐培养基上则更偏黄色。佩龙（1804年）和潘切里（1872年）描述称，火萤在死亡后会发出黄色至绿色的光，受到刺激时则呈红色；随后光线会依次变为橙色、黄色、绿色，最后变成天蓝色。波利曼蒂（1911年）指出，火萤正常情况下发出的光是绿色，而当火萤死亡或处于高于最佳生存温度的环境中时，其发出的光会变得更红。麦克德莫特（1911年）发现，将萤火虫置于液态空气中时，它们在即将熄灭之前会发出明显的红色光；重新加热后，最初出现的灯光也是红色的，而在较高温度下则会恢复到正常的颜色。我经常观察到，当向萤火虫的发光组织中加入酒精等凝固剂时，其发出的光会变得更红。此外，我还发现，在低温（0℃）和高温（50℃）环境下，鲤鱼藻发出的光都会变弱且更偏黄色。这些颜色变化的意义将在第七章中详细讨论。

任何光源的效率都可以用多种不同的方式来定义：（1）通过可见光波长在总辐射量中所占的百分比来表示，即可见光辐射量除以总辐射量（包括热辐射、可见光辐射和紫外线辐射）；（2）除了考虑可见光辐射量与总辐射量的比例外，还要考虑人眼对不同波长的敏感度，即可见光辐射量乘以人眼的视觉敏感度再除以总辐射量。可见光辐射量乘以视觉敏感度这一数值被称为亮度；（3）根据消耗一定能量后产生的光量（以烛光为单位）或根据能量成本来衡量效率。因此，白炽灯发出的辐射中只有很小一部分是光，其余的都是热能和紫外线。所以它的效率远非100%。如果白炽灯发出的辐射中没有红外线或紫外线，那么在忽略人眼视觉敏感度的情况下，其效率就可以达到100%。但考虑到人眼对黄绿色最为敏感，即便某种光源只发出可见光，也只有当其最大辐射强度与人眼的最大视觉敏感度相同时，其效率才能达到100%。我们将在后面的段落中再次讨论这个问题。从能耗的角度来看，碳丝白炽灯每4.83瓦特的能量就能产生1个标准烛光强度的光，而钨丝白炽灯则需1.6瓦特才能产生同样的光强，能量消耗大约仅为前者的三分之一，因此钨丝白炽灯的效率更高。由于我们对生物体在发光过程中发生的能量转换几乎一无所知，所有关于其发光效率的描述都是基于可见光辐射与总辐射量之间的关系。这就需要测量红外线区域（热辐射）和紫外线区域（紫外线辐射）的辐射强度，以及可见光辐射本身以及其他产生的辐射能量。虽然所有的光谱分析都表明，发光生物的光谱从未延伸到红色或紫色部分的可见光谱范围，但在红外线或紫外线区域仍可能存在特定的光谱带，因此必须使用特殊方法来检测这些光谱带。各种类型的辐射在照射到热电堆、玻罗计或辐射计的黑色表面时都会转化为热能，可以通过温度变化来测量这些热能，再将不同能量值换算成统一的单位——卡路里来进行比较。通过适当的过滤，除了可见光之外，其他所有类型的辐射都可以被测量出来。

将其与测量仪器隔开，便可确定以光和总辐射形式表现出来的能量数值。杜布瓦在1886年首次使用热电堆和检流计对火萤的这一现象进行了研究，发现其发光区域产生的辐射量略多于非发光区域；这一差异对应的检流计偏转角度为0.95°，而在昆虫受到电刺激而闪光时，这一数值还会增加0.3°。这0.3°的增幅很可能是由肌肉收缩产生的热量所致。无论如何，与蜡烛相比，火萤所辐射的热量确实非常少。朗利和韦里在1890年使用玻罗计对这一现象进行了更深入的研究。他们首先指出，火萤最强发光器官（腹部）发出的总辐射虽然只会对他们的玻罗计产生轻微影响，但在相同的10秒时间内，却足以使直径为1厘米的普通水银温度计的温度上升不到2.3×10^-6℃。由此我们可以大致了解所需测量数据的规模。他们还发现，火萤发出的辐射实际上只是由昆虫的“体热”产生的，而且那些波长为3微米或更长的射线会被不透明玻璃板完全阻挡——这类射线是由温度低于50℃的物体发出的，属于与光相关的不可见热辐射所处的光谱区域之外的范围。随后，朗利和韦里通过在实验中插入玻璃板来阻挡波长大于3微米的射线，比较了非发光的本生灯火焰与火萤光的辐射强度，结果发现本生灯火焰的辐射强度要高出数百倍，不过火萤光仍然存在可检测到的辐射。本生灯火焰的辐射由波长小于3微米的辐射热以及可见光射线组成（由于本生灯火焰不发光，其波长为0.7微米）。火萤光所产生的极微弱效应则应来自波长在3微米到0.468微米之间的射线，而这正是火萤光谱中的蓝光范围。朗利和韦里认为这种效应完全是由波长在0.640微米到0.468微米之间的可见光带产生的，且不存在不可见的辐射射线。因此，火萤光的所有能量都位于可见光范围内，其效率（可见光射线除以热量、光线及紫外线射线之和）将为100%。后来，朗利在1902年再次研究了火萤的辐射现象，但并未检测到任何加热效应。

关于玻罗计的问题……“在相同条件下，标准蜡烛火焰中与昆虫发光区域面积相当的那部分火焰所产生的玻罗计效应极为强烈；即便昆虫释放的热量仅为蜡烛热量的1/80,000，也肯定能够被检测出来。”Coblentz（1912年）同样使用由铂和铋制成的真空热电堆，未能检测到Photinus pyralis发出的任何红外辐射，但他发现这种萤火虫的体温略低于周围空气的温度。这些温度测量结果将在后面的章节中讨论。

Langley和Very显然认为，萤火虫的体温与哺乳动物或鸟类的体温一样，都高于其周围环境的温度。

Langley和Very认为透过玻璃后能穿透的那些微弱的火光全部属于可见光，这一假设遭到了Ives（1910年）的质疑。他指出，Langley和Very没有使用能够阻挡可见光以及3µ至0.7µ波段之间不可见光的滤光片，因此他们实际上并未弄清：火光对玻罗计产生的影响究竟来自可见光波段，还是来自该波段加上红外波段的其他光线。“萤火虫作为光源的实际效率在很大程度上取决于其辐射是否仅限于可见光范围。如果存在与可见光强度相当的红外辐射，那么尽管萤火虫仍是一种非常高效的光源，但它也就不再像人们通常认为的那样，是自然界中理想高效光源的典范了。”

Ives通过荧光摄影法进一步研究了这个问题。“简而言之，这种方法是这样操作的：各种物质在受到短波长光（蓝色、紫色或紫外线）照射后会发出荧光，而当它们受到长波长光（橙色、红色、红外线）照射时，这种荧光就会消失。因此，将Balmain涂料或Sidot混合物的表面置于短波长光下使其发出荧光，然后再将其放入分光镜中观察，那些被长波长光照射过的区域亮度会降低。如果将这个表面短暂地放在照相底片上，经过显影处理后就能在底片上留下永久性的记录。”初步测试表明，该方法适用于像萤火虫发出的那种弱光，也适用于像萤火虫发光那样间歇性的光源。对于Sidot混合物（ZnS），其熄灭作用的范围是从λ=0.6µ到λ=1.5µ。而深红宝石玻璃则可以阻挡萤火虫的所有可见光，但允许红外光通过。

用于透射的红色玻璃被放置在萤火虫发出的光与具有荧光特性的Sidot混合物之间，该混合物在萤火虫光的照射下持续了3.5小时。其荧光并未出现衰减现象；而如果没有使用这种红色玻璃，由于可见光中的橙色光线作用，荧光在20分钟内就会明显衰减。因此，在λ=1.5µ这一荧光摄影方法的最低波长范围内，根本不存在与可见光强度相当的红外光。Coblentz（1912）研究了各种萤火虫干燥后的几丁质外皮的红外透明性（见图10），发现其在λ=2.8µ之前仍保持相当高的透明度，在λ=2.8µ至λ=3.8µ之间则变得不透明，再往长波方向则又恢复透明，但超过λ=6µ后则再次变得不透明。由此可见，如果存在红外光的话，它应该能够大部分穿透这种吸收特性类似于复杂碳水化合物的外皮。至于该外皮对紫外线的透明性，则尚未有人进行研究。

图10——萤火虫外皮对红外辐射的透射率（引自Coblentz）。

尽管关于萤火虫（Photinus）光谱的照片显示其仅延伸到蓝色光谱的起始部分，但Forsyth（1910）指出发光细菌也会发出紫外线。他将感光板置于经石英棱镜分解后的细菌光谱下照射了48小时，结果在λ=0.50µ（感光板的最低灵敏度阈值）到λ=0.35µ的范围内都观察到了连续的荧光带。不过，McDermott（1911 d）未能观察到对紫外线有反应的对氨基邻磺基苯甲酸的荧光现象。Molisch（1904，书籍）通过玻璃和石英片对细菌光及真菌光进行了拍照，但未发现两者之间存在任何差异。

板上的密度值。由于曝光时间很短，为避免饱和现象，再加上能够穿透石英却无法穿透玻璃的紫外线对板子的作用远大于可见光，因此可以断定其中不存在紫外线。艾夫斯在1910年使用石英分光镜研究了萤火虫的光谱，结果在λ=0.216µ的范围内并未发现任何紫外线辐射的迹象。由此可见，人们对萤火虫发出的辐射进行了非常仔细的研究，除了可见光范围内的狭窄波段（λ=0.67µ至λ=0.51µ）之外，从λ=1.5µ到λ=0.216µ的范围内并没有任何辐射产生，而波长超过λ=1.5µ的情况下也很可能不存在辐射。因此，萤火虫的光源效率高达100%，这与其他所有人造光源都不同——即便是最优秀的人造光源，其效率也远远达不到这一水平。正如兰利和弗里在论文标题中所说的，这是一种“最廉价的光源”，这里的“廉价”并非指我们可以以比其他光源更低的成本来制造它，而是指它在能量利用效率方面最为出色。这种能量全部为光能，没有热能。实际上，萤火虫已经实现了“冷光”的产生，而且“我们完全有办法成功模仿它”。

图11——各种萤火虫以及碳光灯的光谱能量曲线（引自Coblentz）。
我之前已经指出，我们还可以从人眼的敏感度角度来考量光源的效率。也就是说，我们不仅要考虑光谱中的能量分布，还要考虑到相同能量下不同波长的光对人类眼睛的影响程度是不同的。由于正常适应光线的双眼对λ=0.565µ的黄绿色光最为敏感，因此具有该波长的单色光会比具有相同能量的其他波长的单色光显得更亮。从人眼敏感度的角度来看，λ=0.565µ的单色光就是理论上最有效的光源。这正是测定人造光源发光效率的常用方法，其计算依据就是辐射能量与人眼敏感度的关系。发光效率 = 光通量（辐射能量×视觉敏感度），或者用亮度除以总辐射能量来表示。

图12——不同研究者采用不同方法所得的可见度曲线（引自Hyde、Forsyth和Cady的研究）。

图13——4瓦碳丝发光灯的发光效率，阴影区域÷总面积

（引自Ives和Coblentz的研究）。
图14——萤火虫的发光效率，即阴影区域面积除以总面积（引自Ives和Coblentz）。
萤火虫的光谱能量曲线是由Ives和Coblentz在1910年通过摄影方法测定的。他们通过测量全色感光底片上发生的光化学变化程度，比较了萤火虫（Photinus pyralis）不同波长光线的强度与碳弧灯的强度。图11展示了同一光谱区域内各种萤火虫及碳弧灯的能量曲线。Ives和Coblentz所使用的视觉敏感度曲线源自Nutting在1908年和1911年的研究，该数据基于Konig的实验结果，如图6所示。最新的视觉敏感度曲线则由Hyde、Forsyth和Cady在1918年提出，如图12所示，这一曲线是基于对29只个体的观察得出的。由于不同个体对不同波长的敏感度存在很大差异，因此该曲线仅代表平均值，但却是我们用来评估所谓“光”的能量的唯一标准。颜色——

盲人的视觉曲线与正常人有着极大的不同。图13和图14分别展示了4瓦碳丝灯与萤火虫的发光效率与可见度之间的关系。在这些图表中，发光效率是指阴影区域面积除以总面积，碳丝灯的发光效率为0.43%，而萤火虫的发光效率则为99.5%。这些数值表示在相同辐射能量下，通过光度计测得的灯光强度的相对值——这充分体现了人工照明方式的低效性。通过与碳丝灯相比，我们得知钨灯的发光效率为1.3%，汞弧灯的发光效率为3.8%。因此，最高效的人工光源的发光效率也仅相当于萤火虫的4%左右。按此计算，其功率约为0.02瓦/支。后来的一些研究（Coblentz，1912年）采用了Nutting（1911年）提出的针对部分适应光线的眼睛的新敏感度曲线，得出的结果为：Photinus pyralis的发光效率为87%，Photinus consanguineus的发光效率为80%，而Photuris pennsylvanica的发光效率为92%。

图15——光谱能量曲线、亮度曲线及可见度曲线（源自Gibson和McNicholas的研究）

A. Hefner灯的光谱能量曲线。
B. 乙炔火焰的光谱能量曲线。

C. 钨（充气式）荧光灯的光谱能量曲线。
D. 绝对温度为5000°时的黑体光谱能量曲线（即阳光的光谱）。
E. 蓝天的光谱能量曲线。
Hg. Heræus石英汞灯的光谱能量曲线。
Lv. 人眼的可见度曲线。
La. Hefner灯的发光强度。
Le. 蓝天的发光强度。

各种人造光源的发光效率已由Ives在1915年进行过计算，这些数值与萤火虫的发光效率一起列于表6中。图15展示了各种光源在λ=0.590µ时的光谱能量曲线，以及Hefner灯和蓝天的发光强度曲线；此外还给出了Coblentz和Emerson在1917年通过对130名受试者进行观察后得出的可见度曲线。

表6 各种光源的发光效率

效率
（可见辐射量 ÷ 总辐射量）= 光通量/瓦特，再乘以每瓦特的视觉感知度，最后除以光源的额定值）

碳丝白炽灯：平均每小时4瓦特，视觉感知度约为2.6，数值为0.0042；采用经过处理的灯丝。
钨丝白炽灯（真空型）：平均每小时1.25瓦特，视觉感知度约为8.0，数值为0.013；工作温度为600摄氏度，电流为20安培，功率因数为0.5，属于串联类型。马自达C型灯具的数值为19.6，视觉感知度为0.032。
碳弧灯（开放式）：电流为9.6安培，透明灯罩时视觉感知度为11.8，数值为0.019；开放式结构，黄色火焰，带有倾斜式装饰，电流为10安培，直流电压为44.7伏特，数值为0.072。
石英汞弧灯：电压为174-197伏特，电流为4.2安培，数值为0.068。
玻璃汞弧灯：电压为40-70伏特，电流为3.5安培，数值为0.037。
能斯特灯：数值为4.8，视觉感知度为0.0077。
乙炔灯：每小时耗气量为1升，视觉感知度为0.67，数值为0.0011。
石油灯：视觉感知度为0.26，数值为0.0004。
布雷6型高压明火燃气燃烧器：视觉感知度为0.22，数值为0.00036。
低压白炽燃气灯：每英热单位每小时可产生350流明，视觉感知度为1.2，数值为0.0019。
高压白炽燃气灯：每英热单位每小时可产生578流明，视觉感知度为2.0，数值为0.0032。
萤火虫型灯具：数值为629.0，视觉感知度为0.96。

通过上述效率计算方法得出的萤火虫光线的效率并非100%，因为其最大波长（λ = 0.567µ）与人眼的最佳感知波长（λ = 0.565µ）并不一致。若再考虑颜色带来的其他影响，萤火虫光线作为人工照明光源的效率将会更低，因为所有物体都会呈现出近乎统一的绿色色调。实际上，这种色偏甚至会比汞弧灯更严重，而汞弧灯那令人不悦的绿色色调已是众所周知的问题。“因此可以说，萤火虫在追求高效方面走得过远，其产物虽在能量消耗与发光量之间达到了最佳平衡，但却以牺牲色彩范围为代价。若同时考虑色彩与能量-光线之间的关系，最适合人类使用的光源应是类似萤火虫光线的光源，即仅包含可见光谱内的辐射，且为白色光源。”（Ives，1910年）虽然尚未确定萤光藻光线的光谱能量曲线，但可以肯定的是，萤光藻的光谱比萤火虫的光谱要长得多，更接近于能发出白光的白炽灯的光谱。不过它仍未能达到理想状态。

尽管村冈（1896年）以及辛格和莫利克（1911年）描述过来自萤火虫的辐射能够穿透不透明物体并影响照相底片，杜布瓦也报告了细菌具有类似特性，但苏克斯兰德（1898年）、舒里格（1901年）以及莫利施（1904年）都否定了这种辐射的存在。莫利施对发光细菌进行的实验尤为值得关注，因为这些实验控制极为严格，结果明确表明，无论是黑纸还是锌、铝、铜制成的金属板，都无法让这些生物体发出的辐射穿透并影响照相底片，即便经过数天的曝光也是如此。而发光细菌发出的可见光在曝光1秒后就能影响照相底片。此外，莫利施还指出了那些声称在发光生物体中发现了穿透性辐射的人们的错误。某些种类的纸板，尤其是黄色纸板，或是木材，会释放出一些蒸汽，从而影响照相底片。在25°–35°C的温度下，潮湿的纸板所产生的影响更为明显，而杜布瓦和村冈很可能就是使用了这类纸板来覆盖他们的照相底片。将一块干燥的山毛榉或橡树树干放在照相底片上，在完全黑暗的环境中放置15小时，就能拍出树木年轮、髓射线以及树皮与木质部交界处的清晰图像。拉塞尔（1897年）此前就发现，许多物质，无论是金属还是有机物质（如树胶、木材、纸张等），一旦与照相底片接触就会对其产生影响，他由此推断，起作用的其实是蒸汽而非射线。由于干燥的木材有明显的气味，它会释放出一些物质，这些物质能够影响我们的嗅觉，因此完全有可能通过化学作用改变照相底片。通过在两者之间放置玻璃片，就可以避免木材对底片产生的这种影响。弗兰克兰（1898年）也描述过普通蛋白芽孢杆菌和大肠杆菌菌落所释放的类似蒸汽，这些蒸汽同样会对照相底片产生影响。

将感光板直接放置在敞口培养皿中的细菌群落上方。即便在感光板与细菌之间有培养皿的玻璃盖，也不会产生任何影响。因此，那些发光组织不会发出特定的X射线或类似穿透性辐射，从而通过不透明屏障影响感光板。从另一个角度分析也会得到类似的结论：X射线和镭射线能够使ZnS、铂氰化钡、硅锌矿（Zn2SiO4）以及钨酸钙发生荧光。Coblentz在1912年指出，萤火虫的光不会使铂氰化钡屏产生荧光；而我使用黑纸遮挡Cypridina生物发出的光线后，也未能检测到硫化锌、铂氰化钡、硅锌矿或钨酸钙的荧光，尽管这种生物发出的光强度足以让硫化锌在没有黑纸的情况下发出磷光。上述四种物质在镭射线照射下都会出现荧光，但只有ZnS在光照后会继续发光，而硅锌矿则在紫外线照射后才会发出荧光。低强度下的光度测量本身就已经相当困难，如果光线强度不断变化或为闪光形式，那么进行精确测量几乎是不可能的。因此，有关动物发光强度的数据必须结合测量的难度来理解。除非另有说明，所谓“蜡烛光强”指的是国际标准蜡烛光强，相当于1.11个Hefner蜡烛光强、0.1个戊烷灯光强以及0.104个Carcel单位，这是一种用来表示光强度的指标。

光量或光通量以流明为单位，指的是功率为1烛光的点光源在单位立体角（面积除以r²）内发出的光量。1烛光可发出4π流明的光。在λ=0.566时，光的机械当量值为0.0015瓦特（Hyde、Forsyth和Cady，1919年），也就是说1流明等于0.0015瓦特。1瓦特相当于每秒10^7尔格（即1焦耳）。

表面的照度是指1米距离处的1支蜡烛所产生的照度，这一单位被称为烛光米或勒克斯。此时该表面每平方米会接收到1流明的光。1米烛光则是指1米距离处的1支Hefner蜡烛所产生的照度。

表面的亮度以朗伯或毫朗伯来衡量。1朗伯是指“每平方厘米辐射或反射1流明的完美漫射表面的亮度”。1毫朗伯相当于1朗伯的1/1000。如需更多定义，可参考照明工程学会的命名委员会报告。

Dubois（1886年）指出，Pyrophorus noctilucus这种昆虫的胸节器官所发出的光强度约为8磅当量的Phoenix蜡烛的1/150（大概相当于1/150烛光）；37或38只这样的昆虫（每只都使用其三个发光器官）共同发出的光强度则相当于1支Phoenix蜡烛。Langley（1890年）发现，从人眼看来，Pyrophorus noctilucus的胸节器官发出的光强度仅为同等面积蜡烛的1/8，而这种昆虫的实际烛光强度则为1/1600烛光。可以看出，这些观测结果之间存在很大差异。

对于萤火虫（Photinus pyralis）的闪光，Coblentz（1912年）发现其光强度在1/50到1/400烛光之间，其中最常见的数值约为1/400烛光。有时这种昆虫也会发出持续稳定的光亮，其强度约为1/50,000烛光。

对于那些能够持续发光的光源，其光强度则更容易测量。我们有两份关于具有持续发光特性的生物的光强度记录。其中一种生物是Photoblepharon palpebratus这种鱼，它的眼睛下方有一个扁平的椭圆形发光器官，尺寸为11×5毫米，能够持续发光且光强保持不变。这个发光器官可以通过类似眼睑的遮盖物变暗。Steche（1909年）测得其光强度为0.0024米烛光。[3]

[3] 烛光米是一种表示照度的单位，而非光强度的单位，Steche错误地将其用于表示光强度。

发光细菌的发光强度很可能低于其他任何生物。单个发光细菌发出的光是看不见的，但由多个细菌组成的群体所发出的光则能在适应黑暗环境的眼睛中被看到。即便如此，我们仍需记住：眼睛是一种极为敏感的器官，能够检测到极其微小的能量变化。Reeves在1917年计算出“肉眼可感知的最小辐射量”约为每秒18×10^-10尔格，而少量发光细菌群体发出的光其辐射量也仅略高于这一数值而已。

洛德在1904年和1908年通过改良后的油脂斑点光度计方法，测得其最亮的弧菌菌落所发出的光强度为每平方毫米7.85×10^-10赫克尔，或每1000平方米0.785赫克尔（相当于每1000平方米0.562德国标准烛光）。换算成整数的话，大约是每2000平方米有一支德国标准烛光，这一数值是普通石蜡烛光在该面积上发光强度的两到三倍。洛德计算认为，如果罗马圣彼得大教堂的穹顶被细菌覆盖，其发出的光强度也仅略高于普通石蜡烛光而已。而面积为50平方米的普通房间，其光源产生的光强度仅为0.039德国标准烛光。因此，发光细菌似乎不太可能被用于照明用途。弗里德伯格和多普纳在1907年通过摄影法进行了研究，尽管该方法存在一定误差，但他们发现，光合细菌培养物每平方毫米的发光强度为6.8×10^-9德国标准烛光，这一数值约为洛德测定值的十倍。即便如此，利用发光细菌进行商业照明也似乎并非值得投资者投入的领域。

总而言之，动物源产生的光与普通光源产生的光并无本质区别，不同之处仅在于强度和光谱范围。这类光都属于可见光，不含红外线或紫外线，也无法穿透不透明物体。它本身不是偏振光，但可以通过尼科尔棱镜使其偏振。与普通光一样，动物源产生的光也能引发物质的荧光和磷光反应，影响照相底片，导致植物幼苗出现明显的向光性（纳德森，1903年），还能促进叶绿素的生成（伊萨琴科，1903年、1907年）。由于细菌光源的强度较弱，徒长的植物幼苗看起来并不会变绿（莫利施，1912年），不过仍会生成少量叶绿素，其吸收带可通过分光镜检测出来。

第四章 发光器官的结构
光的产生与光的检测是相反的过程。在光产生的过程中，化学能转化为辐射能；而在光检测的过程中，则是辐射能转化为化学能。萤火虫的发光器官属于化学光变器官，而眼睛则属于光化学变器官。从理论上讲，所有在光的作用下按某一方向进行的反应，在没有光的情况下都可能朝相反方向进行，但目前唯一被明确证实的例子就是氧荧光素转化为荧光素的过程（详见第六章）。或许我们也可以将光致发光现象归入这一类别，但由于其中涉及的化学反应尚无法确定。

我们尚未发现有任何动物的眼睛——这种本应作为光化学变器官的眼睛——能在黑暗中发光。所有能够发光的眼睛现象都被证明纯粹是反射作用的结果。只有当有外部光线进入眼睛并被反射出来时，猫的眼睛才会发光。不过，光化学反应和化学发光反应有一个共同点，那就是它们大多属于氧化反应，但并非全部如此。目前还不清楚动物眼睛中的所有光化学变化是否都需要氧气，但所有能够产生光的动物反应无一例外都是氧化反应，而且只有在有氧气存在的情况下才会产生光，因为此时会有某些物质被氧化。

一般来说，我们可以根据可氧化物质是在细胞内被氧化还是被分泌到细胞外后再被氧化，将发光生物分为两大类：细胞内发光和细胞外发光。许多具有细胞内发光能力的动物拥有极为复杂的发光器官。有趣的是，视觉器官的演化过程与这些复杂发光器官的演化过程之间存在很大的相似性。在最简单的单细胞生物中，细胞内的某些结构充当着光化学传感器；而在会发光的原生动物中，散布在细胞内的颗粒在光照作用下会被氧化并产生光。在更高级的生物中，眼睛包含与感觉神经相连的光敏细胞、晶状体以及用于调节光线的辅助结构；而发光器官则包含与运动神经相连的产光细胞、晶状体以及用于引导光线的辅助结构。值得注意的是，在眼睛发育最为成熟的两类生物——头足类和脊椎动物中，其发光器官也呈现出最复杂的结构与最高的完善度。在进化的中间阶段，眼睛和发光器官在结构上极为相似，以至于那些存在于蠕虫和甲壳类动物体内的某些器官究竟是用于接收光还是产生光，至今仍是一个有争议的问题。

我们还可以根据发光物质的氧化过程是持续不断地、无需任何外界刺激即可进行，还是间歇性的——即只有在受到刺激时才会发生氧化和发光——来将发光生物分为两类。这里所说的“刺激”与神经或肌肉组织中所说的刺激含义相同。细菌、真菌以及少数鱼类能够持续不断地发光，且不受任何刺激的影响。其发光强度只会随着时间的推移而发生变化，这一变化取决于培养基的性质或生物体的整体生理状态。其他所有的生物则只有在受到刺激时才会发光。刺激可以来自内部（如神经），也可以来自外部。只有在不利条件下，比如那些最终会导致发光细胞死亡的条件下，这些生物才会持续发光。这种现象常被称为“死亡之光”，可与肌肉组织的僵直现象相类比。

有些能够持续发光的鱼类拥有类似眼睑的可移动遮盖物，它们可以将这个遮盖物拉过发光器官，从而切断光源，因此这类鱼类看起来似乎属于那种需要外界刺激才会发光的物种。Photoblepharon就是如此，而Anomalops则能够将发光器官向下旋转，使发光表面贴在身体壁上，从而切断光源（Steche, 1909）。其他一些鱼类（如Monocentris）则无法“关闭”自己的光源。

那些能够通过内部神经的刺激而自发发光的动物，其发光节奏各不相同。不同的萤火虫种类可以通过其发光特征来区分（McDermott, 1910-17; Mast, 1912）。图16展示了北美东部一些常见物种的发光方式。萤火虫的发光现象……

这种发光现象会持续数秒，随后便消失。这样的黑暗状态会持续几分钟，之后又会进入另一个发光期。有些萤火虫的发光行为属于间歇性发光：其发光可以持续数小时，但在受到刺激时亮度可能会减弱或增强。

图16——显示美洲萤火虫发光强度与持续时间的图表（引自McDermott）。垂直方向上1厘米约相当于0.02烛光强度；水平方向上1厘米约相当于1秒。雄性萤火虫的发光点位于图表左侧，雌性则位于右侧。

有些生物只在一年中的特定季节才会发光。根据Giesbrecht（1895）的研究，桡足类动物仅在夏季和秋季发光；而根据Greene（1899）的研究，蟾鱼属的Porichthys物种也只在春季和初夏的繁殖季节才会发光。有些动物具有规律性的发光特性：它们只在夜间发光，在白天则不会对刺激作出反应，或者很难被激发发光。强光会对它们的发光行为产生抑制作用。或许与此相关的是，大多数能够发光的生物都具有强烈的负向向光性。萤火虫在白天隐藏起来，直到黄昏时分才出现；而介形类甲壳动物Cypridina在月光充足的夜晚也很难被找到。栉水母是最早被发现存在光抑制效应的生物，这一现象由Allman（1862）首次描述，后来也有许多研究者对此进行了验证，尤其是Peters（1905）。Massart发现，夜光藻在白天很难被激发发光；而Zacharias（1905）和Moore（1908）都指出，角水母只在夜间发光，或者只有在处于黑暗环境中时才能短暂发光。Crozier[4]发现，如果将一种名为Ptychodera的舌形虫置于持续黑暗的环境中八天，它仍会保持昼夜节律性的发光行为：在相当于白天的时段里它很难被激发发光，而在相当于夜间的时段里则稍有触碰就会发出明亮的光芒。另一方面，还有许多生物的发光行为并不受先前光照条件的影响。根据Crozier[4]的研究，Chætopterus在暴露于3000烛光强度的光线下六小时后，其发光能力依然不受影响。[4]个人通讯。

对于具有细胞外发光功能的动物来说，我们可以将其分为能分泌发光物质的动物以及真正具有发光腺体的动物。许多生物都具有发光腺体或腺细胞，其中包括一些水母、水螅类（可能）、羽枝虫类（？）、软体动物（Pholas和Phyllirhoë）（可能）、某些头足类动物（Heteroteuthis和Sepietta）、大多数环节动物、介形虫、桡足类、某些裂足类动物（Gnathophausia），以及十足类甲壳动物（Heterocarpus和Aristeus）。所有的多足类动物以及舌唇贝类也属于这一类。而其余的生物则不具备发光功能。

细胞内的这些生物包括细菌、真菌、原生动物、某些水母（？）、栉水母（很可能）、大多数头足类动物、少数环节动物（如Tomopterus（？））、海蛇尾类（？）、一些裂足类动物（如Nyctiphanes、Euphasia、Nematocelis、Stylochiron）以及十足类甲壳动物（如Sergestes），还有所有的昆虫、Pyrosoma以及鱼类（鲨鱼和真骨鱼）。正是在这类生物中，演化出了最为复杂的发光器官。虽然此处无法详述所有类型的发光器官与发光结构（Dahlgren和Mangold已给出了非常详尽的描述），但有必要了解那些生理特性最受关注的几种生物的结构特征。发光细菌体型极小，单个细菌产生的光亮根本无法被观察到；几乎不可能分辨出细胞内的结构差异，也无法确定发光现象究竟发生在哪个特定区域——如果真的存在这样的区域的话。我们只知道光是在细胞内部产生的，而且将细菌从培养基中过滤出来后，得到的滤液是黑暗且无菌的，其中不含任何发光物质。在原生动物中，至少在某些种类中，可以很容易地观察到发光现象与球状或颗粒状结构有关，早期的观察者认为这些就是油滴。例如在夜光藻中（图17和18），当这种生物受到强烈刺激或处于会使其逐渐死亡的试剂环境中时，其整个体内会出现大量闪烁的光点，而这些光点实际上源自质丝上的微小颗粒（Quatrefages，1850年）。图17：夜光藻，显示了细胞质中的发光颗粒。n为细胞核；c为含有发光颗粒（较大）及其他颗粒（较小）的质丝；p为咽部；f为鞭毛；o为口沟；t为触手；s为触手基部的刺；v为液泡。由E. B. Harvey绘制。

图18——发光时的夜光藻形态（引自Quatrefages的描述）。左上角和中间为低倍视野；下方为高倍视野；右上角为已被压碎但仍能发光的碎片。
至于多细胞生物，那些拥有能够分泌发光物质的腺细胞的动物，其发光现象最为简单。这些腺细胞可能散布在动物的体表，如Chætopterus（图19）和Cavernularia中的情况；也可能仅存在于某些特定区域，如Pholas（图19）；或者更集中地形成一群独立的腺细胞，如Cypridina中的情况。当然，也存在着真正意义上的多细胞腺体。不过，在所有情况下，这些单细胞或多细胞腺体的发光现象都与颗粒的存在有关。它们常被称为荧光素颗粒，不过目前尚不确定它们是由荧光素、荧光酶构成，还是两者兼有（详见第四章）。这类颗粒与腺细胞中大量存在的酶原颗粒极为相似，后者被认为是各种酶的前体。根据Dahlgren（1915）的研究，经过沸点固定处理后，荧光素颗粒会因铁苏木精的作用而呈现蓝黑色，通过这种选择性染色方法可以检测出具有发光能力的细胞。Dubois（1914）则将这些颗粒视为生物蛋白的实例，认为它们类似于线粒体，并且会代代传递，因此将其命名为液泡小体或巨酶。他在某些研究中观察到这些颗粒会转化为晶体，一度认为动物的发光现象是一种晶体发光现象。不过他所展示的晶体转化图像并不够令人信服。Pierantoni（1915）则认为这些颗粒是共生的发光细菌，但实际上并非如此。

图19——Pholas（右侧）与Chætopterus（左侧）的示意图，显示了发光区域的分布情况（引自Panceri）。Chætopterus的发光物质来自混合在动物几乎整个体表所分泌的黏液中的特殊成分。上皮组织的切片中可见较大的黏液生成细胞以及较小的、含有颗粒的发光细胞（见图20）。这些细胞似乎受神经控制，因为对身体某一部分的强烈刺激会引发发光现象，且这种发光会扩散到虫体的整个表面。不过，这类动物很容易疲劳。在Pennatulida科的生物中，如Cavernularia，其整个体表也会产生发光分泌物，而且这种群居结构的各个个体之间也通过神经相连。正如Panceri在1872年首次发现的那样（见图21），对某一部位的刺激会引发一股发光波，从该点开始向外扩散，最终覆盖整个群体。在Pennatula中，这种发光波的传播速度约为每秒5厘米。

图20——Chætopterus发光上皮的剖面图（根据Dahlgren的图示）。cu：角质层；l.c.：光细胞，其中一些正在分泌物质；d.l.c.：已分泌完物质的空光细胞；m.c.：黏液细胞。

图21——Pennatula的示意图，箭头标出了从受刺激点(s)开始在群体中扩散的发光波的传播路径（根据Panceri的图示）。

Pholas dactylus拥有的光细胞与Chætopterus的类似，但这些光细胞仅分布在虹吸管和外套膜的狭窄区域以及收缩肌附近的一对三角形区域内。神经会延伸至这些发光区域。在许多发光动物中，体表产生的发光分泌物量很少，且由于嵌入了黏液性皮肤分泌物中而附着在动物体表。而在那些具有真正局部化发光腺的动物中，当这些发光分泌物被释放到海水中时（如果该动物是海洋生物的话），它们仍可能以发光条纹的形式存在一段时间，并表现出扩散和对流运动。最漂亮的发光分泌物实例可见于介形类甲壳动物中。

图22——Cypridina hilgendorfii的发光腺（根据Yatsu的图示）。2为纵向切面，4为横向切面。

图23——Cypridina中一个放大的腺细胞（根据Dahlgren的图示）。P为细胞核与质体；C为细胞质；F为分泌纤维；D为充满大型黄色颗粒的储存管；O为细胞在身体表面的瓣状外开口。

在Cypridina hilgendorfii中，发光腺位于口部附近的上唇处。它由细长的纺锤形细胞构成，每个细胞的末端都有一个带瓣状的独立开口。这些开口分布在五个突起上。肌纤维贯穿于这些腺细胞之间，通过收缩可将分泌物挤出。在海水中，这些分泌物会发出明亮的光芒，日本人将这类生物称为“umi hotaru”，即海洋萤火虫。图22展示了该结构的示意图。最早研究这种生物的Watanabe（1897年）以及Yatsu（1917年）描述了两种含有颗粒的细胞：一种含有直径为4-10微米的大型黄色球体（见图23），另一种则含有直径为0.5微米的小型无色颗粒。我在活体中观察到了这两种类型的细胞，还有与黄色球体大小相同的无色大球体。这些颗粒一旦被挤出到海水中就会溶解。Dahlgren[5]通过切片观察发现了四种类型的细胞：(1)大型球体，(2)小型颗粒，(3)类脂肪物质，(4)黏液物质。目前还无法确定这些物质的性质及其功能，但至少有一种，很可能有两种，与光线的产生有关。其余的则可能形成用于消化动物食物的消化液。[5]相关研究成果即将发表。

至于那些具有细胞内发光功能的发光细胞的生物，一般来说，这类发光细胞会聚集在一起形成特定的发光器官。这些发光器官可能是单个的，如普通萤火虫；也可能是成对的，如Pyrophorus的前胸发光器官；又或者分散在身体表面，如许多虾类。

头足类动物和鱼类所具有的发光结构通常被称为光器官。这些发光细胞往往与反射层、透镜、不透明屏障以及彩色屏障共同存在。

图24——Bolitophila的马尔皮基管远端部分，显示出其向发光器官的演化过程（引自Wheeler和Williams的研究）。MT1、MT4为构成发光器官的马尔皮基管；R为反射层；M为肌肉；T为气管。

昆虫拥有最简单的细胞内发光结构，即由大量发光细胞构成的结构。在北美洲东部的普通萤火虫中，这些发光细胞很可能源自脂肪体；而在新西兰的萤火虫——一种双翅目昆虫的幼虫（Bolitophila luminosa）中，则是马尔皮基管中的某些细胞获得了发光能力（Wheeler和Williams，1915年）。图24展示了这一结构。萤火虫的发光器官由两种细胞组成：背侧是一层多层深的小细胞，即反射层；腹侧则是一层边界不清晰的大细胞，即发光层（见图25）。这些发光细胞内含有大量颗粒，雄性萤火虫的颗粒呈球形，而雌性萤火虫的颗粒则为短棒状。大型气管贯穿这些发光细胞，将其分成多个小组，这些气管会分支成更小的气管支，并与气管末端细胞相连。不同物种中这种结构的分布有所不同，但无论如何，这种结构都能为发光细胞提供充足的氧气供应。每组发光细胞都被不含颗粒的透明细胞质所包围。这些气管支要么直接通向发光细胞内部，要么与相邻气管中的气管支相互连接。神经可以进入该器官，但昆虫没有血管，因此无法确定神经是为气管末端细胞还是发光细胞提供营养。

图25——萤火虫发光器官的剖面图（根据Williams的研究），显示了上方的反射层或晶体层（U）以及下方的发光细胞（P）。C为表皮；T为气管；c为气管末端细胞的毛细血管；H为皮下组织；EC为气管末端细胞；N为神经。
背侧的反射层由含有大量微小晶体的细胞构成，这些晶体可能是黄嘌呤、尿酸或两者兼有。它们呈现出白色乳状外观，虽然从光学角度来看并非良好的反射体，但可以起到白色背景的作用，散射入射光，并部分阻止光线穿透到萤火虫的内部器官。尽管在发光细胞及身体的其他细胞中也存在与反射层类似的晶体，但已知发光细胞并不会转变为反射细胞。这两层结构从发育早期起就是彼此独立的。
有趣的是，萤火虫幼虫的发光器官与成虫的截然不同。与昆虫的许多其他结构一样，成虫的发光器官是在蛹期由具有发光潜能的细胞重新发育而成的。就连萤火虫的卵也具有发光性，能发出稳定的光亮；在蛹期时，有时还能看到胸部区域有光亮出现。
萤火虫没有真正的透镜，光线只是透过覆盖在发光器官上的透明表皮散发出来，而身体其他部位的表皮则是深色且带有色素的。在深海虾Acanthephyra debelis中，发光器官分布在身体表面，覆盖在发光器官上的表皮形成了一个凹凸透镜，其后方即为发光细胞（Kemp，1910）。如图26所示，该透镜由三层结构组成，这表明它可能具有消除色差的功能——堪称真正的“消色差三重结构”。在另一种相近的物种Sergestes中，透镜则由两层构成，呈双凸结构。Trojan（1907）对这些发光器官的光学特性进行了研究。光线传播路径如图28所示。这些器官的透镜也呈蓝色，这说明它们可能还具有滤色功能。在发光细胞后方是一团结缔组织，神经便通过这些组织传递信号，因为这些器官发出的光是由动物控制的，可以随时被控制而闪烁。

图26——Acanthephyra debelis的感光器官的剖面图（根据Kemp的图示）。n：神经；s.l.：细胞包被层；g：神经末端的折射颗粒锥体；c：细胞层；i.l.、m.l.、o.l.：晶状体的内层、中层和外层。

图27——Sergestes prehensilis的感光器官的剖面图（根据Terao的图示）。bm：基底膜；cs：感光层的结缔组织束；hy：皮下组织；l1、l2、l3：晶状体的各层；le：晶状体上皮；n：神经；ph：感光细胞；pi：色素层；r：反射层；th：囊膜。

图28——Nyctiphanes Conchii的感光器官结构图，展示了源自光细胞层的光线路径（依据Trojan的研究）。p：色素；ri：内反射层；lp：光细胞；rf：折射层；f：焦点；l：透镜；A-A：轴线；a1-a4、b1-b4：从ri反射出的光线；c1-c4：直接向外传播的光线；d1-d9和e1-e9：分别经过折射层和透镜的光线。
从上述虾类中的结构到鱿鱼和鱼类中的结构，感光器官的复杂程度存在多种变化。图29和图30展示的是鱿鱼中两种较为复杂的感光器官的切面图。
关于这些结构的解释源自Chun（1903）的研究，正是他通过对这些结构的细致组织学研究为我们提供了相关知识。值得注意的是，除了感光组织和透镜组织外，还有各种类型的反射细胞，以及覆盖在器官整个内表面的色素层，这些色素层能够有效防止光线照射到动物的其他组织上。在某种类型中（见图30），在发光区域周围还存在色素细胞，它们显然起着颜色过滤的作用。此外，这些感光器官还拥有丰富的血液供应以及通向它们的神经。图30和图31则是鱼类感光器官的切面图。
由此可见，感光器官既可以非常简单，也可以非常复杂。复杂的感光器官必定是由简单的结构演化而来的，不过并不总能找到其中的中间阶段。本书并不涉及生物发光的进化过程，不过简要介绍一下动物如何利用光线或许还是很有意义的。共有四种可能性。

图29——乌贼Abraliopsis（Chun.所绘）的感光器官的剖面图：refl1、refl2为反射细胞；lac.为腔隙；chr.为色素细胞的色素屏；chr.1为色素细胞；phot.为感光细胞；l为透镜；co.为角质层；v为血管；fibr.为结缔组织。
(1) 光线可能毫无用处，仅仅是某种必要或不必要的化学反应的附带产物而已。发光细菌和真菌似乎就是如此，而构成海洋浮游生物的绝大多数生物——夜光藻、甲藻、水母、栉水母，甚至是固着生活的海笔，也可能属于这种情况。

图30——乌贼Calliteuthis的感光器官的剖面图（Chun.所绘）：phot.为感光细胞；l、l1为透镜；n为神经；spec.为“Spiegel”结构；pg.为色素屏；c.fusif.为纺锤形反射细胞；chr.为色素细胞的色素屏。

图31——鱼类Stomias的发光器官的剖面图（根据Brauer的图示）。p为色素层；dr、dr1为发光腺细胞；l为透镜。
我们知道，发光细菌有时会失去发光能力，在某些培养基上会以不发光的形式存在。发光对它们来说并非不可或缺。某些真菌也是如此，但夜光藻及其他动物则从未被发现有过不发光的状态，尽管我们看不出这种发光能力对它们有什么实际作用。

图32——鱼类Argyrophelecus affinis的发光器官的剖面图（根据Brauer的图示）。p为色素层；dr为发光细胞；r、r1为反射结构？；l为透镜？；s为巩膜；g为结缔组织。
不过对于海笔而言，我们可以推测光线具有吸引小型生物的作用，而海笔正是以这些生物为食，不过这些生物只有在受到某种刺激时才会发光，这一事实反而削弱了上述推测。
(2) 光线也可能起到警示作用，以此吓退那些可能会捕食发光生物的掠食性动物。也许海笔就是如此，不过海笔拥有刺细胞，本应能提供足够的保护。另一种海洋蠕虫Chætopterus具有很强的发光能力，它一生都生活在不透明的管状结构中。如果这个管子被掠食者撕开，我们可以设想掠食者会被光线吓到而放弃攻击。不过Chætopterus无法重新生成新的管子，因此它的发光能力只能在其夜间提供保护。这些例子足以说明这一问题的复杂性。或许我们还可以再做一个猜测：某些鱼类的发光功能实际上是为了使敌人失明或分心，或是为了让它们所捕食的生物失明。在尚未观察到这种发光功能的实际作用之前，我们很难相信这一说法。
(3) 光线可能作为一种识别手段或性别信号，帮助不同性别的个体相遇交配。从Mast和McDermott的研究来看，普通萤火虫确实如此；蟾鱼Poricthys在繁殖季节才会发光；百慕大的蠕虫Odontosyllis在释放卵子和精子时会发出强烈的光芒，而在其他时间则不会发光（Galloway和Welch，1911年）。
(4) 最后，那些拥有复杂发光器官的动物，如鱿鱼、鱼类和虾类，很可能将这些器官当作灯笼来使用。值得注意的是，它们大多生活在永恒黑暗的深海中，因此很合理地推测它们会利用这些发光器官来照明。

关于发光器官的用途与功能这一整个问题，其实极为复杂且难以解答。或许我们已经说了足够多的内容来说明这一点；另外还可以补充的是，在大多数情况下，只要观点是基于实际证据和观察得出的，那么普通人的见解与科学家的见解具有同等的价值。

第五章 光产生的化学原理，第一部分
在生物发光现象被研究的早期，就有两项实验对于理解动物发光的机制具有极其重要的意义。如前所述，波义耳在1667年证明了空气是木材和鱼类能够发光的必要条件；而斯帕兰扎尼则在1794年发现，发光水母的某些部位在干燥后会停止发光，但一旦再次湿润就会像以前一样发出光亮。由此可见，空气（氧气）、水以及某种光敏物质都是光产生的必要条件。斯帕兰扎尼的实验结果在许多能够发光的生物身上都得到了验证，这一结果也表明，动物的发光并非一种生命活动——就如同神经冲动的传导并非生命活动一样。神经在干燥或浸渍后会失去其传导功能，而发光细胞则能在干燥或浸渍后依然保持发光能力。用早期生理学的术语来说，光产生并不需要“活的原生质”。

波义耳（1626–1691）的实验也非常有趣，尤其是那些他利用抽气泵来研究发光木材行为的实验。1667年10月29日，他写道：
“实验一：我找到了一块大小约相当于一粒谷物、能够发出明亮光芒的发光木材（那是腐烂的木材）。我将它放入一个中等大小的容器中，确保它不会接触到容器的底部。启动抽气泵后，在最初的5到6次抽气过程中，我发现这块木材的亮度并没有明显减弱（当然也没有增强）；但到了第7次抽气时，它的亮度似乎有所下降，之后随着空气被不断抽出，它的亮度越来越低，最终在大约第10次抽气时，尽管我们把房间里的蜡烛都拿走了，还用黑色布料遮住光线，试图让环境尽可能黑暗，但我们仍然无法看到任何光从那块木材中散发出来。”
“实验二：于是我们逐渐让外部空气重新进入容器，结果发现那看似已经熄灭的光芒又迅速且完美地恢复了，看起来简直就像一道小闪电。而且那块木材的亮度甚至比放入容器之前还要高。”

波义耳证明了木材发出的光能够穿过真空，后来他还发现“发光鱼”的行为与“发光木材”类似，不过一块烧红的铁在将空气重新引入已抽空的容器后并不会恢复发光，而铁之所以会失去光泽，只是因为温度下降了。不过，发光的煤在缺乏空气的情况下确实会失去光芒，但只要空气没有长时间被抽走，重新引入空气后它就能再次发光。显然，波义耳对发光煤与发光木材在发光机制上的相似性印象深刻，他通过比较两者，揭示了燃烧过程之间的本质相似性。
“相似之处：
第七点：我发现发光木材与燃烧的煤在以下五方面存在相似之处：
1. 它们都是光源，也就是说，它们自身就能发光，而非像镜子或白色物体那样，只能依靠太阳光或其他光源的反射才能发光……
2. 发光木材和燃烧的煤都需要空气的存在（而且必须是足够浓度的空气，才能使它们持续发光）……
3. 当周围的空气被抽走，导致它们暂时失去光芒时，只要让新鲜空气进入，它们就能再次发光……
4. 燃烧的煤和发光木材都很容易被水和其他液体熄灭……”

5. 就像普通的煤不会因为空气温度过高而熄灭一样，发光的木头也不会因同样的空气条件而失去光芒……
差异点：
1. 我观察到的活煤与发光木头之间的第一个差异是：活煤的光芒很容易因受压而熄灭（比如踩在煤上就能立刻使其熄灭），而我发现，即便对发光木头施加一定的压力，其光芒也不会被熄灭或受到严重影响，哪怕只是对较小的木块施加压力也是如此……
2. 腐烂的木头与燃烧中的煤之间的另一个差异是：后者在空气被抽走后几分钟内就会完全熄灭；而发光的木头在空气被抽走后，只要在半小时内再次让空气进入，它就能立刻恢复光芒……
3. 另一个差异是：活煤放入密闭的玻璃容器中后，无法持续燃烧很长时间；而发光的木头则可以连续发光数天……
4. 第四个差异是：煤在燃烧时会释放出烟雾或气体，而发光的木头则不会……
5. 第五个差异是：煤在燃烧过程中会迅速消耗自身能量，而发光的木头则不会……
6. 最后一个差异是：活煤实际上非常热，而发光的木头则几乎感觉不到温度升高。
需要明确的是，如果我们将细菌或真菌等能发光的生物置于缺氧环境中，发现它们不再发光，这可能只是因为细胞的某些功能受到了干扰，包括光合作用，但这并不一定意味着光合作用过程中真的消耗了氧气。不过，如果我们发现，没有细胞的发光细胞提取物或发光分泌物在缺氧环境下会停止发光，而在重新通入氧气后又重新发光，那么就可以确定光合作用本身确实需要游离氧。由于萤火虫、扇贝虫、介形虫等生物的发光提取物在缺氧环境下也不发光，因此可以肯定，这些生物的发光过程也需要氧气。细菌、真菌以及夜光藻虽然也是完整的细胞，但它们的发光也会在缺氧环境下消失，因此也可以推断它们的光合作用也需要氧气。
一些早期研究萤火虫和夜光藻的科学家们发现，即使将这些生物置于缺氧环境中，它们仍然会发光，但他们并未意识到产生光所需氧气的量其实非常少。水中的微量氧气就足以引发发光现象。如果这些生物的数量很多，比如在含有发光细菌的乳液中，它们会耗尽所有的氧气，此时液体除了与空气接触的表面外，就不再发光了。贝杰林克在1902年进行的一项实验可以帮助我们了解发光所需的氧气量。他将发光细菌与含有叶绿体的三叶草叶片乳液混合在一起，将两者置于黑暗环境中，直到所有氧气都被耗尽，细菌也停止发光。此时，如果点燃一根火柴，短短几秒钟内通过光合作用产生的氧气就足以让细菌再次发光。
目前还无法给出发光所需的最低氧气浓度的精确数值。即使向Cypridina hilgendorfii的发光分泌物中通入含氧量为0.4%的氢气，即部分氧分压为1/250个大气压（3.04毫米汞柱），它仍然会发出大量光线。不过，如果在正在发光的Cypridina分泌物中加入新鲜的酵母细胞乳液，光线就会立刻熄灭，因为酵母能够利用混合物中最后的氧气。只有通过搅拌使更多空气溶解进来，光线才会重新出现。Cypridina发光所需的最低氧气浓度为……

其浓度介于3.04毫米汞柱与活酵母无法从溶液中提取出的浓度之间，后者几乎接近于零。很可能更接近后一个数值。当氧气压力从0升高到约7毫米汞柱时，Cypridina的发光强度会增加，在该压力下其发光亮度与溶液中被空气饱和时的亮度相当（152毫米汞柱氧分压）。由此可见，这种发光现象只需要较低的氧气压力，其与血红蛋白与氧气结合的特性极为相似：正如血红蛋白在低压力下就会接近氧气饱和状态并呈现鲜红色一样，这种发光物质在低压力下也会被氧气饱和而发出强烈的光亮。波义耳还进行了许多实验，证明空气是动物生存和种子发芽所必需的，并指出经过多次呼吸的空气已不再适合继续使用。大约在同一时期，R·胡克揭示了呼吸运动的真正意义，他通过风箱不断向肺部输送空气，从而让动物得以存活。他得出结论：“由于没有新鲜空气时肺部的简单运动对动物的生存没有任何帮助，因为动物在肺部不活动时与活动时一样能够存活；因此，导致死亡的直接原因并非肺部的停止运动或不动，而是缺乏足够的新鲜空气供应。”关于肺部功能衰竭导致的死亡原因，如今已有非常明确的解释。早在很久以前，人们就已经认识到肉体或木材的燃烧、呼吸作用以及发光现象之间存在关联。虽然范赫尔蒙特（1577–1644）以及梅奥（1646–1679）在1674年就已经知道烧炭和葡萄酒发酵过程中产生的“气体sylvestre”（二氧化碳），并且1674年还发现“spiritus nitroærens”（氧气）是维持动物生命以及推动燃烧的关键，但直到一个世纪之后，这些气体的真正作用才被人们了解。在此期间，燃烧的燃素理论逐渐形成，1755年布莱克重新发现了呼出气体中的二氧化碳（“固定空气”），而普里斯特利和舍勒则在1774年分别重新发现了氧气（“去燃素空气”）。大约在同一时间，拉瓦锡推翻了燃素学说，证明了有机物质在燃烧过程中会生成水和二氧化碳。

后来人们发现，这种缓慢的氧化反应并非发生在肺部或血液中，而是发生在组织细胞本身。从化学角度而言，“呼吸”这一概念现在指的是体内细胞中的这种普遍存在的缓慢氧化反应，而非肺部本身的呼吸动作。在无氧呼吸过程中，会释放出二氧化碳，但不会吸收氧气；而在有氧呼吸过程中，则会吸收氧气并释放出二氧化碳。此外，我们还知道有许多物质在吸收氧气的同时并不会释放二氧化碳。我们已经了解到，动物要发光就必须吸收氧气，现在我们可以进一步探究在发光过程中是否会有二氧化碳释放，以及呼吸与光产生的关系。

为了确定发光过程中是否有二氧化碳释放，就需要使用从发光生物体中提取的、纯度较高的发光物质。无法直接使用活的生物体，因为它们不断进行呼吸作用，这会成为一个干扰因素。从一种小型甲壳类动物——萤虾中，可以提取出两种可溶于水的物质（荧光素和荧光酶），将它们混合后就能产生强烈的荧光。我们能够分别测定这两种溶液以及混合后的溶液中的氢离子浓度。

如果发光过程中产生了二氧化碳，那么发光溶液中的氢离子浓度应该会上升。不过，通过氢电极进行的电学测量并未显示出酸度有任何上升。这两种溶液以及它们的混合物的pH值均为9.04，这说明没有二氧化碳产生。

由于这两种发光溶液都含有蛋白质，而发光物质本身很可能也是蛋白质，且蛋白质具有很高的缓冲能力，因此这种检测方法的灵敏度并不高。不过，我们可以肯定的是，产生的二氧化碳量不足以被检测出来，而这很可能是由于发光物质本身的缓冲作用所致。毕竟，如果发光与呼吸无关的话，那就几乎不可能有二氧化碳产生。

另一种检测二氧化碳产生的方法是测量发光过程中产生的热量。在呼吸过程中被氧化的物质会释放出大量热量，例如1克葡萄糖转化为二氧化碳和水时，会释放出4000卡路里的热量。我们在第三章已经了解到，萤火虫发出的光并不包含红外辐射。但这并不意味着产生荧光的反应不会产生热量。只有几千分之一或百分之一度的温度变化才不会产生可测量的辐射。Coblentz（1912）

他首先使用热电偶作为测量仪器，研究了萤火虫的产热问题。他得出结论：萤火虫的体温略低于周围空气的温度，而发光部位的温度则略高于非发光部位；而死去的萤火虫其体温则与周围环境相同。在萤火虫发光期间，无法检测到明显的温度变化。不过，仍需对萤火虫进行进一步研究。

使用活体动物进行此类测量可能会引入误差，因为动物肌肉的收缩会产生热量，这既可能使发光时的温度上升，也可能掩盖温度下降的趋势。而利用含有上述荧光素和荧光酶的发光动物提取物，则可以避免因肌肉收缩带来的复杂情况。通过将荧光素和荧光酶溶液调整至相同温度后再混合，就可以测出混合过程中产生的温度变化，从而了解荧光素的氧化热。

由于测定产热量具有重要意义，因此将详细介绍这一方法。虽然实验听起来很简单，但实际上操作起来相当困难。若要使两种溶液的温度精确到0.001℃以内，达到温度平衡需要很长时间。经过多次尝试后，人们发现以下装置配置（图33）最为理想。

在一种特殊的无银隔热瓶（A）的内管（D）中放入约10立方厘米的荧光素溶液。在一只壁很薄的玻璃管（E）中放入约1立方厘米的荧光酶溶液，该玻璃管浸没在荧光素溶液中，并与一个小电机相连，从而使玻璃管能够缓慢而持续地旋转，进而搅拌两种溶液。由直径为0.008英寸的铜线（编号30，B和S，带有搪瓷绝缘层）制成的热电偶（L和M）经过石蜡处理后被放入两个管子中，这些铜线通过一个双掷铜开关（C）与一台电阻为35欧姆、灵敏度为310兆欧的Leeds and Northrup d’Arsonval壁式检流计（编号34637，银条悬挂结构）相连。恒定温度接点（N）则放置在一个装满水的大杜瓦瓶（B）中，瓶内水的温度与荧光素溶液的温度大致相同。检流计的刻度每1毫米对应0.003℃，其读数可精确到小数点后一位。通过一根插入装有荧光酶溶液的管子中的玻璃棒（F），可以打破该管子，从而使荧光酶溶液与荧光素溶液混合。

图33——用于测定荧光素发光过程中产热量的装置。
A，特殊保温管。B，用于保持温度恒定的杜瓦瓶。C，双掷开关。D，装有荧光素溶液的试管。E，装有荧光素酶溶液的试管。F，用于打破E的玻璃棒。G，带凹槽的橡胶塞，K，用于固定滑轮绳。H，封闭保温管的软木塞。J，H中的黄铜套管。

图34——显示将两支装有相同温度水的试管混合时温度变化的曲线。0.1个检流计刻度单位对应0.003℃。圆点代表D管中热电偶的读数，叉号代表E管中热电偶的读数。研究发现，即使荧光素酶溶液与荧光素溶液在保温瓶内达到相同温度，该温度也未必与室温相同，因此检流计指针会缓慢移动，反映出温度的缓慢上升或下降。因此在混合荧光素酶溶液与荧光素溶液之前及之后的一定时间内，每隔一分钟记录一次各热电偶在检流计上的读数，并将其绘制成曲线。控制实验也是以与荧光素-荧光素酶实验完全相同的方式进行的，只不过两支试管中装的是水而非荧光素和荧光素酶。图34和图35分别展示了使用水以及发光溶液进行的典型实验结果。

图35——显示将相同温度的荧光素溶液与荧光素酶溶液混合时温度变化的曲线。0.1

检流计刻度的分度值为0.003℃。圆点表示在荧光素溶液中的热电偶读数；叉号则表示在荧光素酶溶液中的热电偶读数。在对照实验（水）和荧光素实验中，将两种液体混合后，温度都会略有上升。5次对照实验的平均温度上升值为0.0054℃，而5次荧光素实验的平均温度上升值为0.0048℃。这种温度上升显然是由于液体混合时的摩擦以及玻璃管破裂所产生的热量所致。对照实验与荧光素实验之间的平均温度上升差异极小（0.0006℃），几乎可以忽略不计。因此我们可以得出结论：如果在发光反应过程中确实存在温度变化，其幅度肯定小于0.001℃，很可能还小于0.0005℃，小到无法用该方法检测出来。

为了制备荧光素溶液，先将2克干燥的Cypridina溶解在20毫升热水中，然后在上述实验中使用其中10毫升的10%溶液。假设干燥的Cypridina中有1%是荧光素，那么0.01克的荧光素在氧化过程中也无法使10毫升的溶液温度上升0.001℃（实际上应为11毫升，因为还有1毫升的荧光素酶溶液被混入了其中）。这意味着1克荧光素在氧化发光过程中释放的热量至少低于10卡路里。由于1克葡萄糖完全氧化为二氧化碳和水时能释放4000卡路里的热量，由此可见，荧光素的氧化反应与葡萄糖的氧化反应属于完全不同的类型。正如我们将会看到的，它可能与还原型血红蛋白的氧化反应或白色亚甲蓝氧化为亚甲蓝的反应类似。根据Barcroft和Hill（1910年）的研究，每克氧化的血红蛋白可产生1.85卡路里的热量。我未能找到关于白色染料氧化过程中热量交换的数据，但可以肯定这一数值也很小。由于荧光素在氧化过程中不会释放可测量的热量，因此有充分的证据支持通过氢离子浓度电学测量所得出的结论，即发光生物在发光过程中不会产生二氧化碳。

在大多数动物细胞中，很明显发光现象并不伴随呼吸作用，因为呼吸是一个持续进行的过程，而光仅会在受到刺激时才产生。的确，在受到刺激时呼吸会加速，我们可能会认为发光是呼吸作用加速的结果；但实际上并非如此，因为在发光生物中，即使温度上升10摄氏度，呼吸作用也会加速250%，但这并不一定会导致光的产生。而在那些持续发光的真菌和细菌中，人们很自然地会认为光是呼吸作用的产物，就像我们知道这些生物会产热一样。早在1855年，Fabre就接受了这一观点，他发现油蘑菇的发光部分在12℃下36小时内每克会释放4.41立方厘米的二氧化碳，而非发光部分则为2.88立方厘米/克。不过这项实验从未被重复过，而且除了发光现象之外，还有许多其他原因可能导致不同部位的真菌具有不同的呼吸速率。事实上，那些呼吸速率较快的植物组织，如正在发芽的种子或天南星科植物的花序，虽然会产生大量热量，但并不会发光。

另一方面，很容易证明，即便在细菌中，发光现象也与呼吸作用无关。Beijerinck（1889年）发现，在他所研究的几种发光细菌中，有一种名为Bacterium phosphorescens的细菌属于兼性厌氧菌，它可以在无氧环境中生长，但不会发光。有些通常能够发光的细菌在高温环境下虽然仍能生长，但却不会发光。Beijerinck（1915年）最近发现，这些细菌在高温环境下持续培养后，会形成不再发光的突变株，当再次被置于适合发光的较低温度环境中时，它们也不会发光。这些不发光的突变株偶尔会重新出现能够强烈发光的返祖型个体。Beijerinck还发现，当Photobacter splendidum暴露在紫外线或强阳光、镭射线或介子射线下时，虽然仍会发光，但不会生长。因此有充分的证据表明，生长和呼吸是与发光完全不同的、可相互分离的特性。实际上，呼吸作用会持续增强，直至达到一个相对较高的峰值，而发光现象则在低于某个最佳值时就会迅速减弱。McKenney（1902年）也发现，Bacillus phosphorescens在0.5%的乙醚环境中可以快速生长，但不会发光。

在细菌中，发光现象被比作色素的形成过程，因为要实现显色功能与发光功能，都需要特定的培养条件。有些能够产生色素的细菌，比如能生成水溶性绿色色素的蓝绿芽孢杆菌，在厌氧条件下仍保持无色状态；此时会形成一种无色的显色物质，而在空气中这种物质会氧化成绿色色素。如果这种无色显色物质在氧化过程中既能产生绿色色素，又能发出光，那就意味着同一种细菌同时具备显色功能和发光功能。发光现象并非仅仅是呼吸作用——那种特定类型的氧化反应——那么简单。

自从斯帕兰扎尼发现水母的发光物质可以被干燥，且重新湿润后会再次发光之后，人们便对其他生物也进行了许多相关研究。火虫、萤火虫、桡足类、介形虫、真菌以及细菌都可以被干燥，其发光物质也能在不同程度上被保存下来。在装有CaCl2的干燥器中，干燥后的发光细菌经过几个月后，一旦重新湿润就会失去发光能力；而介形虫和桡足类即便经过多年干燥后依然能够发光。后者的发光物质似乎可以永久保存，不过干燥后的发光细菌之所以会迅速失去发光能力，很可能是因为它们所含的发光物质极少，而干燥后的介形虫最终也会失去发光能力。事实上，单个介形虫腺细胞中的发光物质含量远远高于相同质量的细菌群落中的含量。

当将干燥后的介形虫发光物质粉末撒入水中时，它会溶解于水，从而在水体中留下清晰的发光扩散痕迹和对流轨迹。许多海洋发光生物在受到触碰时会释放出荧光黏液，这些黏液会附着在手指上。难怪这种发光物质很早就有了名称。1872年，菲普森将其称为“夜光素”，并描述了它的某些性质。他认为从死鱼身上刮下的发光物质（即发光细菌）、电蝎的黏液分泌物以及萤火虫的发光物质都属于这种夜光素；“在潮湿状态下，它会吸收氧气并释放二氧化碳，而干燥时则看起来像黏蛋白。”菲普森还说，这种物质在夏季会在海面上形成一层油状物（他指的应该是甲藻群），在常温下为液态，密度小于水，有类似辛酸的气味，不溶于水但可与水混溶，也不溶于酒精和乙醚；在矿物酸和碱中会分解溶解，且不含磷。从这些描述可以看出，“夜光素”并非指某种具体的化学物质，而是最早用来指代这种发光物质的术语。

许多研究者都认为存在某种特定的物质通过氧化作用来产生光。许多年后，莫利施将这种物质称为“光原”。他将“光原理论”与其他一些关于光产生的观点相对照，后者可被称为“生命理论”，比如普吕格（1875年）认为发光是剧烈呼吸的体现，而贝耶林克（1915年）则认为光是肽胨转化为生物物质过程中的副产品。幸运的是，生物学已经发展到了不再能用“生命过程”来解释生物现象的阶段，我们不得不依靠“光原在氧化过程中产生光”的理论。实际上，现在我们可以进一步了解光原的性质，但我们不应忘记：在生物发光现象被发现的早期，人们就已经认识到水、氧气以及某种光原都是产生光所必需的。

1885年，杜布瓦在这一领域的化学研究方面取得了重大进展。他发现，如果将萤火虫的发光器官浸入热水中，光就会消失且不会再出现；如果将发光器官磨碎，虽然碎片还会发光一段时间，但很快光也会消失。但如果将之前加热过的发光器官与未加热的磨碎器官接触，它们又会重新发光。后来，杜布瓦还发现，用火虫的发光组织进行同样的实验也能得到相同结果：用热水提取出的发光组织液，以及用冷水提取后再让光线消失的发光组织液，混合在一起后又会发出光。杜布瓦（1887b）提出了这样的理论：在热水提取物中有一种名为荧光素的物质，它不会因加热而被破坏；在酶——荧光素酶的作用下，这种物质会氧化并产生光，而荧光素酶则会在加热时被破坏。在冷水提取物中，荧光素酶与荧光素共存，但荧光素很快会被氧化，最终只剩下荧光素酶。将荧光素和荧光素酶的溶液混合后，只要荧光素没有再次被氧化，就会持续产生光。我在美洲的萤火虫、日本的萤火虫以及介形虫Cypridina hilgendorfii中也发现了类似的物质。克罗齐尔[6]报告称，这类物质也存在于另一种舌形虫类——Ptychodera中。

在发光细菌、环节动物Chætopterus、羽枝藻类Cavernularia和Pennatula、鱿鱼Watasenia以及鱼类Monocentris japonica中，都未能证实这类物质的存在。E. B. Harvey（1917年）也在夜光藻中未能发现它们。之所以难以证实这类物质的存在，原因有很多，但此处不予探讨。由此可见，光合素实际上具有双重性质，产生光亮需要两种物质，而且由于它们对加热的耐受性不同，很容易被分离出来。在这方面，生物发光与其他一些生物过程类似，尤其是与某些免疫反应及酶的作用相似。[6] 私人交流。

因此，为了使外来红细胞发生溶血反应，就需要一种不会被适度加热破坏的特异性免疫物质（即双受体或致敏物质），以及一种易受热破坏的补体物质（即亚历克辛）。而酵母汁中的酶在催化葡萄糖进行酒精发酵时，也需要两种物质：一种是耐热的、可透过半透膜的辅因子，另一种则是不耐热、在煮沸时会被破坏的酶本身。只有这两种物质同时存在，葡萄糖的酒精发酵才能进行，而且可以通过半透膜分离这两种物质，或者利用它们对热的不同稳定性来区分它们。已知活细胞的许多其他特性也依赖于两种物质的共同作用——一种易受热破坏，另一种则耐热。根据巴赫的观点，组织的还原作用需要一种还原酶，也就是过氧化氢酶，以及某种易于氧化的物质，比如醛类；这类醛类可被视为辅酶。

由于发光动物产生光亮需要耐热和易受热破坏的两种物质，而且我无法用高锰酸钾、过氧化氢、血液、过氧化氢钡等氧化剂来氧化Cypridina中的耐热物质，因此我将Cypridina中的耐热物质称为“光辅素”（源自phos“光”和opheleo“辅助”），它相当于酵母中的辅酶；而将Cypridina中的易受热破坏的物质称为“光生成素”（源自phos“光”和gennao“产生”），它则相当于酵母中的酶本身。从制备方法和性质来看，Cypridina的光辅素与Pholas的荧光素相似，而Cypridina的光生成素则与Pholas的荧光素酶相似。我还认为光生成素就是光的来源（因此才如此命名），因为将Cypridina光生成素溶液与盐晶体以及其他不可能被氧化的物质混合后，就会发出光亮。不过后来我发现，这一现象是因为光生成素溶液中含有某些耐热物质（即荧光素），这些物质被盐晶体释放出来后便会在光照下被氧化从而产生光亮。因此，我放弃了“发光相关的物质体系与酵母的酶-辅酶体系类似”这一观点，转而采用杜布瓦的命名方式：将易受热破坏的物质称为荧光素酶（即光生成素），将耐热物质称为荧光素（即光辅素）。

Cypridina的荧光素与Pholas的荧光素有所不同：在我尝试过的所有氧化剂作用下，它都不会发生氧化反应并产生光亮，也无法与Pholas的荧光素酶一起产生光亮。不过它在溶液中会自发发生氧化反应，只是不会伴随光亮的产生。我认为，为了准确和明确起见，我们应该在不同动物的荧光素和荧光素酶名称前加上该动物的属名，例如Pholas荧光素、Cypridina荧光素酶、Pyrophorus荧光素酶等等。在许多非发光动物的提取物中，杜布瓦发现了能够氧化Pholas荧光素并产生光亮的氧化剂，我也证实了这一点，但在非发光动物中并未发现能氧化Cypridina荧光素并产生光亮的此类物质。不过我在非发光动物的提取物中发现了一些物质，它们能够释放出高浓度Cypridina荧光素酶溶液中所结合的荧光素，随后荧光素就可以被荧光素酶氧化，从而产生光亮。它们的作用类似于盐晶体，我建议将这类物质称为“光辅助素”，即那些通过释放结合态荧光素来帮助荧光素-荧光素酶反应的物质。将荧光素酶溶液中的结合态荧光素释放出来的最佳方法之一是用氯仿振荡处理，这样就能消除结合态荧光素的干扰作用。显然，荧光素必定是由细胞内的某种前体物质转化而来的；按照常规的生物化学术语，杜布瓦将其称为“前荧光素”或“初步荧光素”，并认为它是由一种名为共荧光素酶的酶转化为荧光素的。证明前荧光素存在的实验最早是由杜布瓦在1907年针对Pholas进行的，此后又有更多相关研究（1917a；1918a和b）。要理解这些实验，就必须记住：杜布瓦是通过三种方法从Pholas中提取荧光素的：(1)用95度酒精从虹吸管中沉淀出粘稠的发光液体，然后将其溶解……

(1) 在水中沉淀（1901a，1907）。(2) 在密闭容器中用90°酒精提取发光器官12小时后再过滤（1896）。(3) 将黏稠的发光液加热至70°C。显然，Pholas中的荧光素在酒精中的溶解度较低，因此只能通过酒精提取法（方法2）或酒精沉淀法（方法1）来获得它。前荧光素（在后续论文中称为preluciferine，1917a，1918a）可通过方法1或方法2制备，只不过此时使用的是经过洗涤已去除荧光素的发光器官（1907，1917a，1918a）。此外，通过煮沸Pholas发光器官的提取物也可获得前荧光素，因为荧光素（在70°C时）、荧光酶（在60°C时）以及辅助荧光酶在沸点以下都会被破坏（1917a）。辅助荧光酶的制备方法为：(1) 将荧光酶溶液加热至65°C（1917a），或(2) 用酒精充分提取Pholas发光器官后，再用水提取其中的部分物质（1918a）。长期用酒精处理似乎会破坏荧光酶，但不会影响辅助荧光酶。将前荧光素溶液与辅助荧光酶溶液混合并静置8-10小时后，就会生成荧光酶，这一现象可以通过KMnO4晶体发出光来识别；而前荧光素则无法产生这种反应。最近，Dubois（1918a）指出，前荧光素其实就是牛磺酸，而Pholas中含有大量牛磺酸，它在辅助荧光酶的作用下会转化为荧光素。不仅是牛磺酸，Byla蛋白胨、卵磷脂以及芦丁也能在辅助荧光酶的作用下转化为荧光素。由于芦丁作为一种糖苷也能被如此转化，Dubois认为这证明了辅助荧光酶属于水解酶。不过，这一结论似乎有些过度了。如果荧光素真的能由蛋白胨、卵磷脂、芦丁和牛磺酸这类性质迥异的化合物经水解作用生成，那它的化学结构必定极为特殊。只需看一下芦丁和牛磺酸的结构式，就能看出这两种物质的巨大差异。

牛磺酸七叶苷
我认为在这些实验中，杜布瓦所使用的其实是荧光素的氧化产物——我将其称为氧荧光素，而非其前体物质。Pholas预荧光素与Pholas共荧光酶的制备方法与用于制备Cypridina氧荧光素的方法类似；因此，更有道理的是在杜布瓦的提取物中寻找氧荧光素的存在，而不是认为牛磺酸和七叶苷能够共同生成荧光素。当共荧光酶溶液与预荧光素溶液混合时，实际上并非由预荧光素生成荧光素，而是由混合物中的某种还原剂将氧荧光素还原为荧光素。事实上，在一篇较新的论文中（1919c），杜布瓦认为他的共荧光酶是一种还原酶，能够通过还原作用（很可能是从氧化态的荧光素开始）来生成荧光素，且并未提及预荧光素。
显然，当荧光素被氧化时，必然会形成一些氧化产物。大多数研究者都认为荧光素的氧化产物较为简单，代表着荧光素分子发生了相当彻底的分解。菲普森（1872年）提到会生成二氧化碳。但我们刚刚看到，在Cypridina荧光素的氧化过程中并不会生成二氧化碳，而且有证据表明该过程根本不会引起任何本质上的变化。正因如此，我将荧光素的氧化产物称为氧荧光素。[7] 如后文所述，荧光素转化为氧荧光素的过程可以与无色染料（白色化合物）转化为有色染料的过程相类比。氧荧光素的化学性质与荧光素相似，而且它也可以很容易地再次被还原为荧光素。
[7] 不幸的是，杜布瓦在1918b年的研究中使用了“氧荧光素”这一术语，但其含义与现在的用法截然不同。他将氧荧光素视为一种仍能通过自身氧化而发光的物质，并将发光过程描述为如下步骤：

“辅荧光素酶 + 前荧光素 = 荧光素。”
“荧光素酶 + 荧光素 = 氧化荧光素。”
“氧化荧光素 + 氧气 = 发光物质。”

我应该将其表示为如下形式：
荧光素 + 氧气 ⇆ 氧化荧光素。
只有在荧光素酶存在的情况下，该反应才会向右进行并产生光。

最后，还有火萤和萤火虫所含的荧光物质。杜布瓦最初将这种物质称为“pyrophorin”，后来则采用麦克德莫特的术语，称之为“luciferesceine”。杜布瓦认为这是一种能够增强光线强度并通过将不可见光转化为可见光来改变其颜色的物质。不过，正如我们所看到的，这一理论虽然很有吸引力，但经不起仔细推敲。

菲普森提出的“noctilucin”虽是最早用来指代发光动物中发光物质的名称，但从化学角度来看，这一名称过于模糊，不足以继续使用。在“luciferin”、“luciferase”、“preluciferin”或“proluciferin”、“co-luciferase”、“photogenin”、“photophelein”、“oxyluciferin”、“luciferesceine”这些名称中，我认为只有“proluciferin”、“luciferin”、“oxyluciferin”、“luciferase”和“photophelein”才是真正对光产生机制研究有重要意义的物质。Luciferin是一种耐热且可透析的物质，它会在热敏感、不可透析的酶样物质——luciferase的作用下吸收氧气并发生氧化反应从而产生光。Luciferin必定来源于某种前体物质“proluciferin”，但我尚未能在Cypridina中证实这种物质的存在，对其性质也一无所知。Luciferin会被氧化成oxyluciferin，后者的化学性质与Luciferin本身相同；而在发光动物及其他生物体内，或者通过无机还原剂的作用，它又可以重新还原为Luciferin。Photophelein则是指那些存在于各种动植物提取物中的物质，它们能够在含有luciferase的溶液中将Luciferin从某种结合状态中释放出来。这一类别中包含了许多未知的物质，这些物质的性质可能各不相同，有的具有热稳定性，有的则易受温度影响而分解。

我们已经知道，生物发光其实是一种氧化发光现象，光是由某种化合物——Luciferin在空气和水的存在下被氧化产生的，而这种氧化反应则由一种类似酶的物质——luciferase加速。在第二章中我们还了解到，只要氧化过程进行得当，许多有机化合物在氧化过程中都会产生光。不过，这些有机化合物往往需要用较强的碱或强氧化剂来氧化，而这类物质会对活细胞造成严重损害。1913年，维勒和德里安在提交给法国科学院的一篇简短论文《一种氧化发光反应的生物化学催化》中指出，lophin在H2O2存在的情况下可以被脊椎动物的血液氧化。同年，杜布瓦发现，来自七叶树皮的糖苷esculin在血液和H2O2的存在下也会发生氧化反应并产生光。在这些情况下，血液中的血红蛋白起到了催化剂的作用，它将H2O2中的氧气转移到esculin或lophin上。血红蛋白的功能可以与luciferase相类比，只不过luciferase不需要H2O2的存在。

由于血红蛋白在煮沸时不会失去这种功能，而荧光素酶则会失去，因此这种类比并不完美。不过，已知有许多氧载体在其溶液被煮沸后会失去功能，比如植物汁液中的过氧化物酶。芦丁与过氧化物酶及H2O2混合后不会发出光，但焦性没食子酸或没食子酸则可以。如果将装有焦性没食子酸溶液与H2O2的试管与马铃薯或芜菁汁液，或是几乎任何植物提取物混合，就会出现黄色荧光。植物提取物在煮沸后会失去产生这种荧光的能力，而过氧化物酶则不会通过透析失去活性。当然，这可以与荧光素酶相类比——荧光素酶作用于热稳定的、可透析的焦性没食子酸-H2O2混合物，而该混合物则类似于荧光素。有趣的是，尽管许多羟基酚类和氨基酚类化合物可以被过氧化物酶和H2O2氧化，但只有焦性没食子酸和没食子酸能在氧化过程中产生光。还有许多其他氧化剂可以替代过氧化物酶。相关列表见第151页。在以过氧化物酶作为氧化剂的体系中，没有其他过氧化物能够替代H2O2，但有一些物质可以用作其他氧化剂来替代H2O2。具体内容见表7。

表7：能与焦性没食子酸及各种氧化剂一起产生光的过氧化物

氧化剂：H2O2、苯甲酰过氧化物、臭氧处理过的Na2O2、BaO2、MnO2、PbO2、K、Na、K
（每分子氢对应3个单位）松节油（粉末）、（粉末）、不溶性过硫酸盐、过硼酸盐、高氯酸盐

所添加的成分包括过氧化氢（一滴）、粉末等。浓度为M/10、M/20、M/10。这些成分被加入至由不溶性粉末构成的混合物中，浓度为M/100。此外还有焦性没食子酸以及过氧化氢。萝卜汁的浓度为1％。淡红色血液的提取物浓度为M 20。K4Fe(CN)6的浓度为M 100；淡黄色物质的浓度也为M 100。KMnO4的浓度为M 10。FeCl3的浓度为M 100。CrO3的浓度为M 100。Na的浓度为淡色、淡黄色、淡白色。次溴酸盐的浓度为闪光型、闪光型、闪光型、闪光型。Ca的浓度为淡色。次氯酸盐的浓度为闪光型。MnO2和Mn(OH)3则溶解在蛋白胨中。还有胶体物质以及银元素。

我们知道存在这类类似的纯有机化学氧化反应，这类反应在发生时会产生光，这一事实大大加强了杜布瓦的理论——即荧光素-荧光酶反应实际上也是一种具有类似性质的催化氧化反应。正如杜布瓦（1914a）所说，在发光生物体内存在着“1° 发光现象；2° 化学发光现象；3° 氧化发光现象；4° 酶促发光现象”。或者，如果我们承认酶本身也是某种活的实体，那么就可以称之为“生物酶促氧化发光现象”。或许，为了真正理解这种光生成过程的本质，我们并不一定非得认为酶是活的才行。

在下一章中，我们将更详细地研究三种主要物质——荧光素、氧化荧光素和荧光酶的性质。

第六章 光产生的化学机制，第二部分
自拉齐谢夫斯基在碱性酒精溶液中研究油脂氧化现象以来，早期研究生物发光的学者们大多认为，能够被氧化的物质就是脂肪或类似脂肪的化合物。细胞中存在的那些能发出光亮的颗粒或球状物也为这一观点提供了支持。
如今我们已知，这些物质并非脂肪滴，而且荧光素与荧光酶均不溶于乙醚、氯仿、苯或汽油等脂肪溶剂中。菲普森对夜光素的性质描述过于粗略且不准确，无法作为参考。杜布瓦仅对他最初研究的火萤属生物中的荧光素与荧光酶的化学性质进行了研究，他发现火萤属生物的荧光酶在受热时会分解，也会被酒精沉淀，而荧光素则不受此影响。荧光素仅存在于火萤属生物的发光器官中，而不存在于血液中；荧光酶则很可能遍布整个动物体内。[8]
[8] 来自R.杜布瓦的私人通讯。

Pholas luciferin——自1887年以来，杜布瓦在一系列论文中研究了Pholas luciferin以及Pholas luciferase的化学性质。他发现这种荧光素在70℃以上会遭到破坏，难以通过透析分离；在Pholas luciferase、KMnO4、H2O2、血蓝蛋白以及各种海洋软体动物和甲壳类动物的血液存在时，它会发生氧化反应并产生光。该物质不溶于脂肪溶剂，但在水中可形成胶体溶液；苦味酸、82℃的酒精以及(NH4)2SO4均无法使其从溶液中沉淀出来。NaCl、MgSO4以及醋酸和碳酸也无法使其沉淀，除非有中性盐存在。它与NH4OH反应后会生成难溶的碱性白蛋白。杜布瓦曾在1887年声称这种物质可以结晶，并认为它属于蛋白质、核蛋白和白蛋白等多种不同类别的物质；最近他则将荧光素描述为具有酸性特性的天然白蛋白。它仅存在于能发光的动物体内，而不存在于不能发光的动物体内，分布于外套膜的各个部位，尤其是虹吸管处；在软体动物的非发光部位则不存在。至今尚未有荧光素晶体的照片被发表过。

Pholas luciferase——Pholas luciferase具备酶的所有特性：在60℃时会遭到破坏，无法通过透析分离，不溶于脂肪溶剂，但在水中可形成胶体溶液。它不受1%的NaF影响，但其活性会在饱和盐溶液、糖或甘油中受到抑制，不过可以通过这种方式保存下来，稀释后其活性又会恢复。它会被胰蛋白酶分解，也会被氯仿等脂肪溶剂类麻醉剂缓慢破坏。因此杜布瓦认为它是一种氧化酶，类似于巴泰利和斯特恩所发现的氧化酶。由于他在长时间用流水透析Pholas提取物后发现了铁元素，杜布瓦认为这种酶与铁有关，并指出它能氧化诸如焦性没食子酸、愈创木胶、α-萘酚和对苯二胺等常规氧化剂。不过，目前仍需证明真正导致这些试剂变色的是pholas luciferase，而非所有细胞中都存在的氧化系统。杜布瓦在许多不能发光的甲壳类动物和软体动物的血液中发现了pholas luciferase或能与pholas luciferin一起产生光的物质（如Barnea candida、Solen、Cardium edulis、Ostraea和Mytilus）。

Cypridina luciferin——尽管已有大量关于能发光的动物的研究，但杜布瓦对Pholas的研究以及我自己对Cypridina和萤火虫的研究，才是唯一真正从化学角度揭示了各类能发光动物体内发光物质性质的成果。在很多方面，Cypridina luciferin与Pholas luciferin相似，但两者之间存在诸多差异，足以证明它们并非同一种物质。正如我之前所强调的，我们不应只谈论“荧光素”和“荧光酶”，而应称其为“各种荧光素”和“各种荧光酶”。作为可被氧化的物质，荧光素更值得我们关注。它们比荧光酶更为简单。如果我们想要像动物一样人工产生光，就必须合成荧光素。Pholas的荧光素在KMnO4及其他氧化剂的作用下会发出光；虽然我尚未成功用氧化剂氧化Cypridina luciferin，但我相信一定能找到某种无机催化剂来替代荧光酶，从而加速Cypridina luciferin的氧化并产生光。Cypridina luciferin最显著的特性就是它的稳定性。在我最初关于Cypridina的论文中，我提到荧光素不会因短暂煮沸而被破坏，但若煮沸四到五分钟就会遭到破坏；同时它在室温下也不稳定，大约一天左右就会从溶液中消失。原因在于……

因为即使在没有荧光素酶的情况下，荧光素也会发生氧化反应，这样一来即便有荧光素酶存在，也无法再产生光亮。这种不会伴随光产生的自发氧化反应，可以通过将荧光素置于氢气环境中或加入酸来防止。在这种条件下，荧光素既可以被煮沸而不被破坏，也可以保存数月而不变质。在空气中煮沸时，荧光素会从中性或碱性溶液中迅速消失，这完全是由于沸点处氧化反应更为迅速所致。由于氧化产物氧荧光素可以很容易地重新转化为荧光素，因此不能认为荧光素是不稳定的——因为它并不会像在存在荧光素酶的情况下那样发生分子结构的破坏。实际上，荧光素在煮沸过程中不仅稳定，甚至能在20%的盐酸（比重为1.1）或4%的硫酸中煮沸10小时仍然保持稳定。而在20%的盐酸中煮沸一天后，荧光素就被完全破坏了；在4%的硫酸中则几乎完全被破坏。在这些情况下，显然不是简单的氧化成氧荧光素，因为在如此强的酸作用下根本检测不到氧荧光素的存在，而是发生了真正的分子结构破坏，很可能是荧光素分子的水解。在探讨荧光素的蛋白质性质时，我们还将再次提到这一点。需要记住的是，许多蛋白质需要在与20%的盐酸一起煮沸四到五天后才能完全水解为氨基酸。荧光素在水中能形成溶液，很可能是胶体状，不过它能够透过羊皮纸或明胶膜。它很容易被各种细小颗粒物质吸附，如骨黑、Fe(OH)3、高岭土、滑石以及CaCO3。我所测试过的各种酶溶液都无法破坏荧光素，这些酶包括作用机制各不相同的胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、唾液淀粉酶和麦芽糖酶、酵母转化酶、脲酶、凝乳酶，以及来自干燥的脾脏、肾脏和肝脏组织中的酶类。通过提取磨成粉末的干燥Cypridina，可以很容易地研究荧光素在非水溶剂中的溶解性；而通过在荧光素的水溶液中加入稀酸、碱、中性盐以及生物碱类试剂，就可以非常准确地了解荧光素的生化特性。为方便起见，本研究的结果列于表8中。
表8 Cypridina所含发光物质的性质

性质：荧光素酶、荧光素
盐析作用：
使用饱和NaCl处理时：不沉淀，不沉淀。
使用半饱和MgSO4处理时：沉淀，沉淀。
使用饱和MgSO4处理时：几乎完全沉淀，部分沉淀。
使用饱和MgSO4加醋酸处理时：……沉淀。
使用半饱和(NH4)2SO4处理时：轻微沉淀，不沉淀。
使用饱和(NH4)2SO4处理时：完全沉淀，几乎完全沉淀。
使用饱和(NH4)2SO4加醋酸处理时：……几乎完全沉淀。
溶解性：
甲醇中：不溶，可溶。
乙醇中：沉淀，沉淀。
90%浓度乙醇中：沉淀，沉淀。
70%浓度乙醇中：沉淀，沉淀。
50%浓度乙醇中：微溶，可溶。
丙醇中：不溶，不可溶。
异丁醇中：沉淀，较易溶解。
戊醇中：沉淀，微溶。
苄醇中：沉淀，可溶。
丙酮中：沉淀，较易溶解。
90%浓度丙酮中：沉淀，可溶。
70%浓度丙酮中：微溶，可溶。
50%浓度丙酮中：较易溶解，可溶。
乙酸乙酯中：不溶，不可溶。

丙酸乙酯：可溶。
丁酸乙酯：可溶。
戊酸乙酯：微溶。
硝酸乙酯：极微溶。
甘油：可溶。
乙二醇：可溶。
醚类：不溶。
氯仿：不溶。
二硫化碳：不溶。
四氯化碳：不溶。
苯：不溶。
甲苯：不溶。
木酚：不溶。
石油醚：不溶。
苯胺：不溶。
冰醋酸：可溶。

生物碱类试剂
磷钨酸：完全沉淀；几乎完全沉淀。
磷钨酸与醋酸：几乎完全沉淀。
磷钨酸与HCl：完全沉淀。
单宁酸：几乎完全沉淀；几乎完全沉淀。
单宁酸与醋酸：几乎完全沉淀。
单宁酸与HCl：几乎完全沉淀。
苦味酸：几乎完全沉淀；不沉淀。
苦味酸与醋酸：不溶。
苦味酸与HCl：不溶。
K4Fe(CN)6与醋酸：不溶。

重金属盐类
碱性醋酸铅：完全沉淀；未完全沉淀。
中性醋酸铅：几乎完全沉淀；未完全沉淀。
中性醋酸铅与醋酸：不沉淀。
氯化汞：不沉淀；未完全沉淀。
氯化汞与醋酸：几乎完全沉淀。
硝酸铀酰与醋酸：未完全沉淀。

酸碱类
NaOH：不沉淀；不沉淀。
NH4OH：可溶。
醋酸：可溶。
H2CO3：可溶。
三氯乙酸：可溶。

由于荧光素在用(NH4)2SO4饱和后几乎完全沉淀，因此可以推断它在水中的存在形式为胶体状态。这就意味着它不属于那些以真溶液形式存在的生化化合物，而应归类为已知的胶体物质，如皂类、蛋白质、多糖、磷脂、半乳糖脂（脑苷脂）、单宁或皂苷。它既不是多糖，因为会被磷钨酸几乎完全沉淀；也不是皂类，因为它不会被钙盐沉淀；更不是磷脂或半乳糖脂，因为它在热或冷的苯中都不溶解。它也不表现出单宁或皂苷的特性。因此，只有蛋白质这一类别符合其特性。根据美国生物化学学会所认定的18种蛋白质类型，荧光素的性质表明它应属于天然蛋白类，处于蛋白类与多肽类之间的过渡地带。尽管荧光素已被(NH4)2SO4几乎完全盐析，但它仍能通过透析，这一事实有力地支持了将其归入此类蛋白质的观点。

另一方面，荧光素具有两种至少对蛋白质而言极为特殊的性质：其一是在酒精、丙酮、酯类等溶剂中的溶解性；其二则是无法被几乎具有普遍蛋白水解能力的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶所分解。在酒精中可溶的蛋白质中，最著名的是植物中的醇溶蛋白，但这类醇溶蛋白既不溶于水，也不溶于无水酒精。玉米中的醇溶蛋白——玉米醇溶蛋白，则可溶于90%的乙醇、甲醇和丙醇，以及加热至150℃的甘油和冰醋酸中。最近，Osborne和Wakeman（1918年）发现了一种来自牛奶的蛋白质，其溶解性与小麦中的醇溶蛋白——麦醇溶蛋白相似。Welker（1912年）则描述了一种从Witte肽胨中提取出的物质，该物质能通过双缩脲试验、Millon试验和Hopkins-Cole试验，它可溶于水和无水酒精，但不溶于乙醚；其他肽胨也可能具有无水酒精溶解性。另一方面，某些蛋白质在缺乏盐类的情况下会在强酒精中形成胶体溶液，而通过加入适当的盐类即可使其沉淀。由于用于提取鲤鱼科昆虫无水酒精提取物的原料是含有海水盐分的干燥物质，因此其中必然存在一定量的盐分，从而有可能形成胶体。如果我们用800毫升的沸无水酒精对已经经过苯或乙醚彻底提取过的干燥鲤鱼科昆虫进行一小时提取，然后通过吸水纸和硬质滤纸过滤该酒精提取物，再将滤液在水浴上快速蒸发至干，最后将残留物溶解在少量饱和了二氧化碳的水中，就会得到一种黄色乳光溶液，这种溶液与荧光素结合后会发出明亮的光芒。该溶液中含有某种蛋白质或蛋白质衍生物，因为它能产生非常微弱的Millon反应，尼林试验结果呈阳性，颜色为红蓝色，但没有双缩脲反应。它会被单宁酸和磷钨酸沉淀，但不会被苦味酸、醋酸、三氯乙酸或铬酸沉淀。该提取物对碳水化合物也会产生微弱的Molisch反应。鉴于有证据表明鲤鱼科昆虫的无水酒精提取物中含有某种蛋白质产物，这种蛋白质很可能是荧光素。不过需要强调的是，虽然尼林试验结果十分明显，双缩脲试验为阴性，但Millon反应却非常微弱。[9] 这样做是为了使溶液略带酸性，从而防止荧光素被氧化。

虽然荧光素不会被胰蛋白酶消化，即使在38℃下放置五天也是如此，但经过约16小时的煮沸后，它仍会因矿物酸的作用而发生水解。某些蛋白质、白蛋白类物质以及发生消旋作用的蛋白质虽能抵抗胰蛋白酶的消化，却会被酸水解。我们还知道，蛋白质中的某些NH-CO键很难被胰蛋白酶分解——因为很难得到不产生双缩脲反应的蛋白质消化产物；Fischer和Abderhalden的研究也表明，某些人工多肽也无法被纯化的活化胰液所消化。

因此，存在三种可能性：要么荧光素是一种不会被胰蛋白酶攻击的天然蛋白质；要么即使被胰蛋白酶攻击，其分解产物（推测为氨基酸）仍含有能够通过光合作用实现氧化的物质；要么它根本就不是蛋白质。我试图利用荧光素酶让各种氨基酸混合物（来自牛肉和酪蛋白的胰蛋白酶消化产物，或是荧光素本身的酸水解产物）发生氧化并产生光，但未能成功，因此我认为Cypridina荧光素要么是一种新的天然蛋白质，可溶于无水酒精且不会被胰蛋白酶消化，要么属于与蛋白质不同的其他类别。没有出现双缩脲反应这一事实也支持了这一观点，这个问题还需要进一步研究。

Cypridina荧光素存在于该动物的发光腺中，也可能存在于非发光部位以及发光器官中。萤火虫的荧光素也是如此，它分布于Luciola、Photuris和Photinus这类昆虫的整个身体中。

至于荧光素酶，则具有复杂蛋白质的所有特性：它无法透过火棉胶或羊皮纸膜，仅能溶解于水溶性溶剂中，因此会被酒精和丙酮沉淀；它能被蛋白酶消化，接触稀酸和稀碱时容易发生变化，煮沸后会不可逆地凝固。用(NH4)2SO4饱和溶液处理后，它会完全从溶液中析出；而用生物碱试剂处理则几乎可以使其完全沉淀。它的其他特性详见表8。综合这些特性来看，荧光素酶最接近于白蛋白类蛋白质。

如果荧光素酶不是蛋白质，那它也与蛋白质结合得极为紧密，以至于无法分离出来。这是许多酶的共同特征，而荧光素酶也是一种酶。我们可以通过检测荧光素酶是否能加速大量荧光素的氧化来确定这一点，因为这正是催化物质的检验方法。如果我们取1毫升浓度较低的荧光素酶溶液（1份Cypridina溶于50毫升水中），然后逐滴加入1毫升的……

当前一次添加的荧光素所发出的光消失后，立即加入浓缩的荧光素（浓度为1 Cypridina对应2毫升溶液）。在加入4次、每次1毫升的荧光素后，便不会再有光产生。这说明荧光素酶已被耗尽，无法再氧化一定量的荧光素。不过在本次实验中，我们加入的荧光素浓度是1个Cypridina所含荧光素浓度的100倍，也就是说，每次添加的荧光素浓度都是正常浓度的25倍。当然，我们无法确定单个Cypridina中荧光素或荧光素酶的绝对含量（以毫克计），但我们知道，1个Cypridina中的荧光素酶最多只能氧化100个Cypridina中的荧光素。如果单个生物体中荧光素与荧光素酶的比例为100:1，那就意味着荧光素酶能够氧化其重量10,000倍的荧光素。荧光素酶可以氧化大量过量的荧光素，但并非无限量的荧光素，我认为这足以证明荧光素酶属于酶的一种，尽管它并非理想的有机催化剂。众所周知，许多酶在催化反应过程中会逐渐失效，或者被反应产物所毒害。而那些因反应产物生成而被抑制的酶反应，只要去除或稀释这些产物，就能再次进行。然而，当将含有低浓度荧光素酶的混合物用水稀释后，就不会再出现光，这说明荧光素酶并非仅仅被某种反应产物抑制，而是在反应过程中真正被耗尽了。顺便提一下，通常被称为氧化酶的过氧化物酶在反应过程中也会被耗尽，而且它们只能氧化有限量的可氧化物质，其氧化量几乎与过氧化物酶的浓度成正比。

目前尚不确定荧光素酶是否是一种由白蛋白与铁、铜或锰等重金属结合而成的氧化酶。普林斯顿大学的A. H. Phillips教授为我分析了整个Cypridina的结构，结果显示，这三种已知与生物氧化相关的金属确实存在于其中，很有可能其中某种金属参与了荧光素的氧化过程。尽管我测试了大量的有机和无机氧化剂，以及来自富含铁、铜和锰的动物血液和组织提取物中的多种氧化酶，但仍未找到能够替代Cypridina荧光素酶的物质。植物的过氧化物酶或氧化酶、血红蛋白、血蓝蛋白、贻贝提取物、各种海洋甲壳类和软体动物的含锰血液，与荧光素混合后都不会产生光。像KMnO4、H2O2、BaO2之类的强氧化剂虽然能够氧化Pholas荧光素并产生光，但却无法氧化Cypridina荧光素。

Cypridina荧光素酶的活性具有极高的特异性。它仅存在于Cypridina hilgendorfii的发光器官中，不存在于非发光部位，也不存在于与Cypridina hilgendorfii亲缘关系较远的非发光物种中。亲缘关系相近的发光生物体内的荧光素和荧光素酶相互作用时会产生光，但如果这些物质来自亲缘关系较远的生物，则不会产生光。例如，萤火虫（Photuris）的荧光素与Pyrophorus的荧光素酶混合时会发出光，反之亦然；但Cypridina的荧光素与萤火虫（Luciola）的荧光素酶混合则不会产生光，与Pholas的荧光素酶混合也是如此。有时在将萤火虫或Cypridina的荧光素酶与非发光生物或亲缘关系较远的发光生物的煮沸提取物混合后，会观察到微弱的发光现象，这很可能是由于煮沸提取物中的光敏物质所致。

与植物过氧化物酶类似，Cypridina荧光素酶也不易受到氯仿、甲苯等物质的影响。但与植物过氧化物酶不同的是，无论是否有H2O2，或是存在诸如焦性没食子酸、α-萘酚、对二氨基苯、愈创木胶等常用作过氧化物酶试剂的羟基酚或氨基酚化合物，它都不会发生氧化反应（即不会产生颜色变化）。此外，荧光素酶也不会与油类、洛芬、焦性没食子酸、没食子酸、七叶树苷等已知可以通过其他方式引发氧化反应并产生光的物质一起产生光。荧光素酶的特异性极高，只会对同种或亲缘关系相近物种的荧光素起作用，因此应将其归为另一类氧化酶。

根据Dubois的研究，Pholas荧光素酶很容易被氯仿破坏，而我的观察也表明萤火虫的荧光素酶也是如此，由此可见，荧光素酶这一类物质之间存在一定的差异性。我所研究的所有发光生物都未被氰化物影响。在向Cypridina、萤火虫、Cavernularia的提取物，或是夜光藻和发光细菌中加入少量或高浓度（m/40）的KCN后，它们的发光能力依然保持不变。在这方面，荧光素酶与许多会被极低浓度的氰化物就抑制的氧化酶有很大不同。不过，这一点也需要牢记在心。

KCN虽然会抑制过氧化氢酶以及铂或银对H2O2的催化分解作用，但并不会影响铊对H2O2的催化分解作用。

氧化荧光素——当荧光素被氧化时，它会转化为某种或某些物质。我认为这种变化并不会导致荧光素分子的结构发生根本性破坏，因为这是一个可逆过程。我这里要讨论的主要产物就是氧化荧光素。如果我们假设荧光素的氧化只会使其分子发生微小的变化，那么我们就可以将荧光素 ⇆ 氧化荧光素这一变化与还原型血红蛋白 ⇆ 氧合血红蛋白的变化相比较。不过实际情况并没有这么简单，因为只要氧分压足够低，氧合血红蛋白就会释放出其中的氧气，而氧化荧光素则不会这样做，至少在黑暗环境中是这样。我们无法通过用空气泵去除溶液中的氧气来使氧化荧光素还原。还有另一种也可以轻易逆转的氧化还原体系，但仅仅去除溶液中的氧气是无法实现其逆转的——那就是像亚甲蓝这样的染料被还原为其无色碱的形式。我认为荧光素被氧化时所发生的反应，与亚甲蓝或靛蓝磺酸钠的无色碱被氧化成蓝色染料时的反应类似。在氧气存在的情况下，这些无色碱会自发发生氧化反应，其过程似乎是失去氢原子并生成水。而这些染料的还原则可以通过与氧化荧光素相同的途径来实现。对于亚甲蓝来说，其还原过程就是添加两个氢原子。至于荧光素被还原时是否也会发生类似的变化，或者是否真的会有氧气被添加进来从而形成血红蛋白，目前还无法确定。我们可以用以下方程式来表示这些可能性：
C16H20N3SCl（无色亚甲蓝）+ O ⇆ C16H18N3SCl（亚甲蓝）+ H2O

血红蛋白 + O ⇆ 氧化血红蛋白。
现在让我们来看看可用于还原氧荧光素的方法。我们可以尝试写出能够体现发光反应中基本变化的方程式。
我试图还原荧光素的氧化产物，最初的观察是：如果将荧光酶的澄清溶液置于高试管中，虽然最初摇晃时不会发出光，但放置一天左右后，摇晃时就会出现非常明亮的光。当荧光酶因细菌生长而变得浑浊且带有异味时，这种情况更为明显。我认为细菌会产生某种可以被荧光酶氧化的物质，于是我在适当的培养基上培养细菌和酵母，几天后，将含有细菌或酵母代谢产物的培养液与荧光酶混合，期望能产生光亮，但实际上并没有光出现。不过，如果在细菌或酵母培养物中加入少量粗制的荧光酶溶液，再静置几小时，摇晃时就会发出光。实际上，这类培养物表现得就像那些已经耗尽了培养液中所有氧气的发光细菌——只有通过摇晃使更多氧气溶解到培养基中时，它们才会发光。考虑到试管中的细菌培养物很快就会处于无氧环境，而且细菌在无氧条件下还具有很强的还原作用（例如对硝酸盐或亚甲蓝的还原作用），我意识到细菌很可能正在将荧光素的氧化产物重新还原为荧光素。我们需要记住，由于粗制荧光酶溶液是从发光动物中提取的冷水提取物，经过一段时间后荧光素已被完全氧化，因此该溶液中既含有荧光酶也含有氧荧光素；只要氧荧光素被再次还原且有氧气存在，就会发出光。这似乎是对上述实验的正确解释。
氧荧光素也可以通过使用鲎的血液来轻易还原，只需让血液静置直到细菌生长出来即可。这个实验特别有趣，因为鲎的血液中含有血蓝蛋白，其在还原状态下是无色的，而在氧化状态下则为蓝色。因此，颜色的变化可以用来指示血液中的氧气浓度。充满细菌的、有异味的鲎血液在试管中静置10到15分钟后会变成无色，但一旦与空气接触，蓝色又会立刻恢复。这样的血液因其所含细菌的活性而具有还原氧荧光素的能力。而新鲜血液则几乎没有任何还原作用。
不仅在细菌中，组织提取物在无氧环境下也具有很强的还原作用。例如，用亚甲蓝染色的肌肉组织，在没有氧气的情况下会很快使亚甲蓝褪色（即发生还原反应），但一旦有空气进入，蓝色又会立即恢复。氧荧光素其实就是已经被氧化的荧光素溶液。

如果将氧化卢西弗林与磨碎的青蛙肌肉悬浮液混合，然后置于装满液体并封口的试管中数小时，氧化卢西弗林就会被还原为卢西弗林，此时若将其倒入卢西弗酶溶液中，就会发出明亮的光芒。单独的青蛙肌肉悬浮液或氧化卢西弗林本身与卢西弗酶反应时不会发光；即使将青蛙肌肉悬浮液与氧化卢西弗林混合并让其在空气中振荡数小时，也不会发光。只有在这种混合物被置于无氧环境中时，氧化卢西弗林才会被还原。

据认为，组织具有还原作用是因为其中存在一种还原酶（还原剂或还原酶），该酶由过氢化酶以及某种易氧化的物质如醛类组成。在过氢化酶的作用下，水中的氧气会氧化醛类，而释放出的氢气则能还原溶液中可能存在的任何易还原物质。新鲜牛奶中也含有过氢化酶，这种酶被称为沙丁格酶，它会被煮沸破坏。如果向新鲜牛奶中加入某些醛类，经过短暂放置后，牛奶就能将亚甲蓝还原为其无色形式，或将硝酸盐还原为亚硝酸盐；一旦与空气接触，蓝色又会重新出现。除非加入醛类或肝脏等组织的煮沸提取物，否则不会发生还原反应。煮沸后的肝脏提取物本身没有还原作用，但它能提供类似醛类的物质，这类物质被称为辅酶。醛类会被氧化成相应的酸。如果牛奶中存在大量细菌，即便没有醛类，牛奶也能还原亚甲蓝。而当牛奶、亚甲蓝和醛类一起在空气中搅拌时，则不会发生还原反应。最适宜的反应温度为60°至70°C。

我发现牛奶是一种非常适合且便捷的用于还原氧化卢西弗林的介质，而且无需添加醛类或细菌即可发挥作用。在卢西弗酶-氧化卢西弗林溶液中，很可能存在着起醛类作用的物质。如果将牛奶加入该溶液中，不会产生光亮；但如果让该混合物在无氧环境下静置，再通入空气，就会发出光亮。可以通过将小试管完全装满溶液并用橡胶塞密封，来有效防止空气进入。

由于几乎所有动物组织都含有还原酶，因此，含有氧化卢西弗林和卢西弗酶的新鲜制备并过滤后的Cypridina提取物，在振荡时不会发光，但在黑暗中于室温下放入封口试管中静置24小时后，通入空气就会发光。这可能是由于产生了具有还原作用的细菌，但这种可能性不大，因为在相同条件下亚甲蓝在24小时内并不会被还原，且试管内也没有浑浊现象或腐败气味。48小时后细菌开始出现，亚甲蓝也会被还原。如果在Cypridina提取物的试管中加入氯仿、甲苯或百里酚以抑制细菌生长，再让其静置48小时，通入空气后，含有氯仿的试管不会发光，而含有甲苯和百里酚的试管则会发光，不过亮度不如没有添加这些物质时的情况。我认为这些物质会对还原酶产生破坏作用，其中氯仿的破坏作用最为显著。杜布瓦（1919c）也记录了Pholas中存在一种还原酶，即“氢化酶”，它能从蔗糖中生成氢气，从Pholas的煮沸提取物中生成卢西弗林。他现在认为这种酶与他的辅卢西弗酶是同一种物质。

我未能证明Cypridina提取物能够在有或没有乙醛的情况下还原亚甲蓝或硝酸盐为亚硝酸盐。这可能是因为其中同时存在的氧化卢西弗林比硝酸盐或亚甲蓝更易被还原，因此首先被还原。我们也可以不用动物提取物来还原氧化卢西弗林，其中最好的方法可能是利用钯黑和次磷酸钠来进行还原。次磷酸钠在钯的存在下会被氧化，从而释放出新生氢气。这些新生氢气可以还原溶液中可能存在的任何易还原物质，如亚甲蓝或氧化卢西弗林。单独使用钯或次磷酸钠无法还原氧化卢西弗林，但单独使用钯黑则可以还原亚甲蓝。

如果将硫化氢通入亚甲蓝溶液中，这种染料会很快被还原而变成无色。如果通过煮沸使无色的亚甲蓝溶液中的硫化氢逸出，冷却后蓝色又会重新出现。氧化卢西弗林也可以被硫化氢还原。

如果在氧鲁西弗林中加入一些镁粉，然后在生成醋酸镁的过程中逐次添加稀释后的醋酸，氧鲁西弗林就会相对较快地被还原。该反应会产生氢气，而氢气无疑就是起作用的还原剂。

稀释的酸有助于氧荧光素的分解还原。如果用二氧化碳使氧荧光素溶液饱和，或向其中加入少量稀释的醋酸、盐酸、硝酸或硫酸，就会发生一定程度的还原反应。而即使让纯氢气饱和该溶液并静置24小时，也不会发生还原反应。正如表9所示，当通常呈微碱性的氧荧光素溶液被调节至中性（pH=7.1）时，酸的作用才会开始。由于溶液中不存在荧光素或其他在加热过程中会被破坏的酶，因此酸的作用必定是针对氧荧光素的。
表9 酸对氧荧光素还原作用的影响

荧光强度与溶液成分的关系
注：实验中使用了荧光素酶。

20毫升纯氧荧光素：9.01，无荧光。
20毫升氧荧光素 + 0.05毫升5%醋酸：8.8，无荧光。
20毫升氧荧光素 + 0.15毫升5%醋酸：7.1，荧光较弱。
20毫升氧荧光素 + 0.30毫升5%醋酸：5.9，荧光良好。
20毫升氧荧光素 + 0.50毫升5%醋酸：荧光良好。
20毫升氧荧光素 + 0.75毫升5%醋酸：荧光良好[10]。

[10] 由于酸性环境会影响荧光素酶的活性，因此荧光会很快消失。

细菌（会产生二氧化碳）、肌肉组织（含有乳酸）、牛奶（细菌可能在其内产生乳酸），或是Mg+酸在生成荧光素的过程中，其作用机制可能并非源于它们的还原能力，而是酸性作用。幸运的是，我们可以通过使用非酸性的还原剂来验证这一点。如果这些还原剂也能从氧荧光素中生成荧光素，那就说明确实发生了还原反应。NaOH与铝反应，或者将细小的镁、锌或铝放入水中，都可以产生氢气。加入镁后，由于会形成几乎不溶的Mg(OH)2，水会变得略微碱性。如果在氧荧光素溶液中加入一些铝粉并滴加稀释的NaOH，就会释放出氢气，从而生成荧光素。由于仅靠添加碱是无法生成氧荧光素的，因此在这个实验中，一定是生成的氢气在碱性环境中对氧荧光素进行了还原。只需在氧荧光素溶液中加入铝粉、锌粉或镁粉，也能生成荧光素。亚甲蓝也可以被锌粉或铝+NaOH轻易还原为其无色形式。实际上，如果在含有荧光素酶的溶液中加入一些铝粉、锌粉或镁粉，只要摇晃溶液，就会出现荧光。荧光素酶溶液中必须始终含有荧光素的氧化产物——氧荧光素。在存在氢气的情况下，氧荧光素会被还原为荧光素；由于溶液呈碱性且存在荧光素酶，当摇晃溶液使空气进入时，荧光素就会被氧化并产生光亮。由于溶液中氧气不足，光线强度不会很高，仅在表面较为明亮。由此看来，细菌、酵母、肌肉细胞等对氧荧光素的作用，不仅与其酸性有关，还与其还原能力有关。

上述实验非常有趣且具有启发性。取一支含有氧荧光素的荧光素酶溶液，再加入一些锌粉或镁粉……

粉末出现后，氢气的生成便开始了。此时条件已有利于氧荧光素的还原反应，因此该反应便会发生。摇晃试管中的内容物以溶解其中的氧气，这时就会产生光亮。让试管静置，光亮很快就会消失；再次摇晃，光亮又会重新出现。这种发光的还原与氧化过程可以重复多次。

通过向荧光素和氧荧光素溶液中加入NH4SH，也可以进行类似的实验。这同样可以作为碱性介质中氧荧光素被还原的另一个例子。每当摇晃含有荧光素、氧荧光素和NH4SH的试管时，都会出现光亮；而当试管处于静止状态时则变暗。哪怕是最轻微的晃动也足以使试管内的物质混合，从而溶解氧气并产生光亮。这就好像我们在刺激试管使其发光一样。我认为这一现象具有更深层的意义，其与刺激现象之间的相似性也比最初看上去的要更为本质。还有比控制氧气的进出更简单的控制方法吗？萤火虫是通过其发光器官中的神经受到刺激来发出光亮的；夜光藻在任何形式的刺激下都会发光，哪怕是最轻微的晃动也会使其发出强烈的光亮。如果刺激过程仅仅意味着向产光细胞中输送氧气，那么细胞本身就拥有自动产生光亮的机制。氧气的进入会创造有氧环境，此时在荧光素酶的作用下，荧光素会氧化成氧荧光素并释放出光亮。当氧气耗尽后，光亮就会消失，无氧环境形成，氧荧光素又会重新还原为荧光素。因此，在夜光藻的静止期或萤火虫两次发光之间，荧光素又会重新生成。还有比这更有效的发光方式吗？

另外，亚甲蓝也与氧荧光素有着有趣的相似之处。在亚甲蓝溶液中加入少量NH4SH，就能使其被还原（褪色）为无色形式。如果此时摇晃试管，蓝色又会重新出现；静置后则又会发生还原反应。这一过程可以重复多次，反应的方向取决于混合物中的氧气含量。

由于亚甲蓝不含氧气，其还原过程实际上就是添加两个氢原子。当无色亚甲蓝被氧化时，这两个氢原子会与氧气结合生成水，反应式如下：
C16H20N3SCl + O ⇆ C16H18N3SCl + H2O
（无色亚甲蓝）（亚甲蓝）

简而言之：MH2 + O ⇆ M + H2O

要还原亚甲蓝，我们可以直接从溶液中生成的新生氢原子中获取这两个氢原子，或者利用催化剂将水分解来获得这些氢原子。

某种物质的存在会消耗水中的氧气，因此会发生如下反应：
NaH2PO2 + H2O + Pd = NaH2PO3 + H2 + Pd
（亚磷酸钠）（磷酸钠）
该反应需要在细分散的钯存在下才能进行。氢气可以还原亚甲基蓝，而亚磷酸盐则会被氧化。

由于氧卢西弗林可以被钯和亚磷酸钠还原（Harvey，1918），因此我们很可能可以用与亚甲基蓝类似的方程式来表示氧卢西弗林的还原以及卢西弗林的氧化过程：
卢西弗林 + O ⇆ 氧卢西弗林 + H2O
简而言之：LH2 + O ⇆ L + H2O。

与亚甲基蓝的情况类似，如果氧气压力足够高，反应会自发向右进行。如果还存在荧光素酶，就会产生发光现象：
LH2 + O + 荧光素酶 ⇆ L + H2O + 荧光素酶（发光）

在低氧压力下，或者在有新生氢气或能够分解水并使氢气转移到氧卢西弗林、氧原子转移到受体A的催化剂存在时，反应会向左进行。NaH2PO2就充当了受体的角色：
L + H2O + A + Pd = LH2 + AO + Pd。

这似乎就是活体组织中的还原酶或过氢化酶（类似于钯的作用机制）发挥作用的方式（Bach，1911-13）。酵母细胞、细菌、肌肉悬浮液等在还原氧卢西弗林时的作用方式也应与此相同。

如果我们假设LH2（卢西弗林）化合物会略微分解为L和氢气，那么氢离子就会使平衡向生成含有氢气的物质的方向移动。因此，通过向氧卢西弗林中加入酸，就可以部分生成卢西弗林。而降低氢离子浓度则会使平衡向相反方向移动。因此，加入碱类有利于卢西弗林的氧化，一般来说，生物氧化反应在碱性环境中更易发生。此外，在碱性介质中，氧气的氧化电位高于中性或酸性介质。我认为这就是酸在将氧卢西弗林转化为卢西弗林过程中起作用的原因。

添加酸并非促使氧荧光素转化为荧光素的唯一方法。从理论上讲，任何能产生光并单向进行的反应，在光照作用下都应能向相反方向进行。据我所知，还从未有过某种反应在某一方向上具有光生特性而在另一方向上具有光化学特性的案例，除非我们考虑荧光现象——例如CaS吸收光后在黑暗中重新发光。不过，荧光过程中发生的反应机制尚不清楚。事实是，光确实能够使氧荧光素发生还原反应：将含有氧荧光素的试管置于阳光下6小时，或置于汞弧灯下2小时，其中的氧荧光素就会部分转化为荧光素。加入荧光素酶后，该溶液会发出光亮；而置于黑暗中的对照管则检测不到荧光素的存在。当使用紫外线时，这种还原作用更为明显——因为在相同时间内，置于石英汞弧灯下的石英管中的氧荧光素溶液比玻璃管中的溶液有更强的还原反应。这种还原作用并不依赖于光照条件下酸的形成，因为将两支含有氧荧光素的试管分别置于黑暗中和阳光下6小时，它们的反应程度是一样的，pH值为9.3。当然，光照作用下可能会生成某种还原剂，但这种可能性不大。因此，我们可以将发光反应表示为如下形式：

黑暗、碱、荧光素酶 → 荧光素（LH2）+ O ⇆ 氧荧光素（L）+ H2O（发光）
过氧化氢酶、酸、光 → ……

在荧光素与氧荧光素的转化反应中，酸和光有利于还原反应，而碱和黑暗则有利于氧化反应。荧光素究竟是通过失去H2而氧化，还是通过吸收氧气而氧化，目前还不确定。不过，这一现象与亚甲蓝的情况很相似，因此在明确荧光素及其氧化产物的组成之前，这一推测可以作为一种临时假设。虽然我尚未像研究荧光素那样全面地研究氧荧光素的性质，但据我的判断，这两种物质会表现出相同的反应规律，并且具有相同的性质。粗制的荧光素和氧荧光素溶液均为黄色，但我认为纯荧光素和纯氧荧光素本身并不是黄色的，因为Cypridina的醚提取物或苯提取物也是黄色的，尽管荧光素酶、荧光素和氧荧光素都不溶于醚和苯。这种黄色色素……

可以发现，构成溞类发光腺组成部分的物质并非荧光素或荧光素酶，而可能是与尿色素相关的色素。当对粗制荧光素和粗制氧荧光素溶液加入沉淀试剂进行测试时，两种溶液都会产生相同的结果。本章已对荧光素的化学性质进行了较为详细的阐述，因此无需再重复关于氧荧光素的描述。与荧光素类似，氧荧光素也能通过瓷滤器，透过羊皮纸或胶质膜，且不会被唾液中的淀粉酶、胃蛋白酶、中性溶液中的默克胰酶以及胰凝乳蛋白酶所分解。将唾液淀粉酶和胰酶（含有淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶）在38℃下放置四天，也并未出现任何分解迹象。

由于荧光素是一种极易被氧化的物质，我们本以为它会像葡萄糖一样具有还原作用。然而，高浓度的荧光素对费林试剂（碱性铜试剂）、巴尔福德试剂（酸性铜试剂）、尼兰德试剂（碱性铋试剂）以及克纳普试剂（碱性汞试剂）均没有还原作用。葡萄糖能在碱性环境中还原亚甲蓝（但在中性溶液中则不能），而荧光素在碱性或中性环境中都无法还原亚甲蓝。由此看来，荧光素中应该不含醛基。如果真是如此，那么我们应该能看到上述某些试剂被还原的现象。目前尚不清楚究竟是哪种基团参与了氧化反应，而在缺乏更多实验数据的情况下，对此进行推测意义不大。

总而言之，至少有三类发光动物——甲虫、Pholas属动物以及Cypridina属动物——的发光现象确实是由荧光素与荧光酶这两种物质在水分和氧气存在下的相互作用所导致的。荧光素与荧光酶具有截然不同的性质，可以通过各种化学方法轻松将它们分开。由于不同发光动物体内的荧光素与荧光酶性质略有差异，因此可以在其所属动物的学名前加上前缀来区分它们。

Cypridina属动物的荧光素与Pholas属动物的荧光素不同，因为它无法被KMnO4、H2O2、含或不含血红蛋白的试剂，或是类似的氧化剂氧化并产生光。此外，Cypridina属动物的荧光酶也与Pholas属动物及萤火虫的荧光酶不同，因为它不会轻易被氯仿、乙醚等脂溶性麻醉剂破坏。当Cypridina属动物的荧光素被氧化时，其分子并不会发生根本性的分解，因为生成的氧化荧光素可以很容易地再次还原为荧光素。这种还原作用是在与所需条件相似的情况下实现的。

诸如亚甲蓝之类的染料的还原。肌组织、肝脏等处的还原酶，或是细菌，以及牛奶中的沙丁格酶、H2S，还有醋酸作用于镁、水或NaOH作用于铝、锌或镁时产生的氢气，以及钯黑和次磷酸钠，都属于众所周知的还原方法。即便存在荧光素酶，只要没有氧气，氧荧光素仍会发生还原反应；在那些在细胞内分解荧光素的动物体内，氧荧光素也会被还原，从而实现物质的循环利用。稀释的碱环境有利于氧化反应，而稀释的酸环境则有利于还原反应。光也有助于氧荧光素的还原。

显然，荧光素与氧荧光素具有相同的化学性质。它们都不会被麦芽糖酶、唾液淀粉酶、酵母转化酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、淀粉酶、凝乳酶、弹性蛋白酶、脲酶，以及从干燥的脾脏、肾脏或肝脏中提取的酶所分解。荧光素酶似乎只有会被胃蛋白酶（很可能还有胰蛋白酶、弹性蛋白酶），以及脾脏和肝脏提取物中的某些物质所破坏。

荧光素酶无疑是一种蛋白质，其各种性质都与白蛋白一致。尽管它在氧化大量荧光素的过程中会被消耗，但它的许多行为特征都类似于酶，因此可以被视为酶的一种。

另一方面，荧光素不会被蛋白水解酶分解，可以通过透析处理，用(NH4)2SO4饱和后几乎可以完全沉淀，可溶于无水酒精、丙酮以及其他一些有机溶剂，但不溶于乙醚、氯仿和苯这类纯脂溶性溶剂。不过，荧光素中存在某些不会被蛋白水解酶分解的CO-NH键，而且也有一些可溶于无水酒精的肽类物质，因此这些特性并不妨碍将其归为蛋白质类。实际上，荧光素与多肽和肽类有许多共同特性，但目前还无法确定其确切的化学本质。

第七章 发光的动力学

关于发光现象，最令人惊叹的一点就是：引发可见光发射所需的物质量极少。以极端情况为例，单个α粒子——即氦原子——撞击ZnS时产生的闪光，用肉眼就能看到。在纯CaS中加入百万分之一的某种重金属，就能使其具备磷光特性。我们不得不认为，在光照过程中这种重金属会参与某种反应，而在光照结束后这种反应又会逆转并产生光，因此只需要极少量的重金属即可。浓度为1:5,000,000的没食子醇水溶液，在K4Fe(CN)6和H2O2的作用下可以被氧化从而发出光（Harvey，1917）；而浓度为1:100的没食子醇与H2O2结合，再与浓度为1:250,000的胶体铂反应，也能产生可见光（Goss，1917）。

来自Cypridina的荧光素和荧光酶，即使在极低的浓度下也能发光。如果将一只Cypridina放在研钵中与水一起研磨，再将提取物稀释到25,600立方厘米，若向其中加入荧光素，就能观察到光亮。通过测定Cypridina发光腺的体积，并假设该体积全部为荧光酶，可以计算出：当加入荧光素时，1,700,000,000份水中只需1份荧光酶就能产生光。同样地，只要加入荧光酶，经过类似稀释的荧光素也会发出可见光。

我们眼睛的敏感度使得我们能够检测到如此微小的能量变化。正如我们所知，最新的研究结果表明，适应黑暗环境的眼睛能够检测到每秒18×10^-10尔格的能量变化。根据没食子醇完全氧化时释放的热量，可以计算出要产生18×10^-10尔格的能量需要多少没食子醇——这个数值极其微小。当没食子醇被K4Fe(CN)6和H2O2氧化时，并不会完全氧化，因此只有少量能量会转化为光；否则的话，我们应该能够看到浓度更低的没食子醇所发出的光。由于荧光素与氧荧光素之间的转化反应很容易逆向进行，所以释放的能量也非常少，实验也表明，光产生过程中几乎不会产生热量。即便如此，极少量的荧光素依然能够产生大量的光。

之所以只需要极少量的荧光酶，是因为它属于酶类，而催化剂通常都以极低的浓度发挥作用。

假设荧光素酶是一种能够催化荧光素氧化并产生光的有机催化剂，那么我们就可以探讨荧光素与荧光素酶的浓度与发光强度及持续时间之间的关系。氧气分压、氢离子浓度以及温度都必须保持恒定，因为这些因素都会影响发光的强度和持续时间。不过，在研究荧光素和荧光素酶之前，让我们先来了解一些著名的化学发光反应，重点关注反应物质的浓度和温度对发光的影响。

温度对发光的影响尤其值得关注，因为它为我们提供了一种分析方法，用以判断发光是否取决于反应速率。我们知道，光化学反应几乎不受温度的影响，因为这类反应依赖于光的吸收这一物理过程，而温度上升10℃时，其反应速率仅会增加很小的百分比。用通常的说法来说，10℃温度变化对应的温度系数（Q10）通常小于1.1。另一方面，那些将部分化学能转化为辐射能的光化学反应，其反应速率越高，产生的光就越强。由于反应速率会随着温度的升高而迅速增加（Q10值为2到3），因此发光强度也应随之迅速上升。

Trautz在1905年通过对酚类和醛类化合物的化学发光现象进行深入研究后得出结论：发光强度与反应速率成正比。他的结论主要基于温度和反应物质浓度的影响，甚至声称只要反应速率足够高，任何反应都会产生发光现象。的确，提高温度确实会增强化学发光的强度，但这种增强作用也仅限于一定范围内。随着温度的升高，化学发光的强度会不断增加，但最终会达到一个最大发光强度的临界温度，超过这个温度后，发光强度又会下降。这一点在表10中所记录的各类氧化剂对邻苯二酚和H2O2的作用中表现得尤为明显。在100℃时，许多氧化剂几乎不会产生光，而这些氧化剂本身在100℃时也不会发生变化。如果我们想将反应速率与发光强度联系起来，那就必须认为光的产生实际上取决于最佳反应速率，而非最高反应速率。

表10　温度与光产生的关系。氧化剂与等量的M/100邻苯二酚+3% H2O2混合。

温度　氧化剂
0-2℃　20℃　50℃　75℃　98-100℃

萝卜汁：微弱、良好、良好、明亮、阴性。
1%血液提取物：微弱、一般、良好、一般。
m/20 K4Fe(CN)6：阴性、良好、明亮、良好。
m/100 KMnO4：一般、良好、明亮、明亮、微弱闪光。
m/50 K2Cr2O7：阴性、一般、微弱、一般、阴性。
m/100 CrO3：阴性、良好、明亮、明亮、微弱。
m/10 KCr明矾：阴性、微弱、微弱、微弱、阴性。
m/10 NH4Fe明矾：阴性、微弱、微弱、微弱、极微弱。
MnO2：阴性、一般、一般、一般、阴性。
NaClO：明亮闪光、明亮闪光、明亮闪光、明亮闪光、一般闪光。

已知有许多实例表明，增加反应物质的量非但不会增强发光现象，反而会导致发光完全停止。这一事实并不支持“反应速率是决定发光现象的关键因素”这一理论。白磷的发光条件极为特殊且有趣。（参见van’t Hoff，1895年；Ewan，1895年；Centnerszwer，1895年；Russell，1903年；Scharff，1908年。）只有当氧气压力处于某一较低值时，磷才会开始发光。这种氧气的“最低发光压力”非常低，以至于早期的研究者由于未能彻底去除氧气残留物，以为磷可以在无氧环境中发光。有趣的是，还存在一个“最高发光压力”——超过该压力后磷便不再发光。在纯氧环境中，磷也不会发光。在最低压力与最高压力之间存在一个“最佳发光压力”，在此压力下磷的发光最为明亮。这些压力的具体数值会随着水蒸气含量及温度的变化而改变。根据Abegg的《无机化学手册》记载，在有水蒸气存在的条件下，0℃时的最高发光压力为320毫米汞柱，且每升高1摄氏度，这一数值会增加13.19毫米汞柱。这意味着在20℃这样的特定温度下，当氧气压力为583毫米汞柱时磷不会发光，但低于此压力的情况下则会产生发光现象。然而，如果提高温度，即使氧气压力达到583毫米汞柱，磷也会发光。与这种情况类似的是吡咯醇溶液在臭氧作用下的氧化反应，只不过在这种反应中，过高的吡咯醇浓度会阻碍氧化过程。我尚未研究过臭氧浓度变化对反应的影响。如果将经过臭氧发生器（一种无声的电放电管）处理过的氧气通入浓度为m/100的吡咯醇溶液中，0℃时不会产生发光现象，20℃时会有较明显的发光，50℃时发光较为强烈，而在沸点时则会出现明亮的发光。如果吡咯醇的浓度为m，那么0℃和20℃时都不会发光，50℃时会有较明显的发光，沸点时则会出现明亮的发光。在20℃这样的特定温度下，如果吡咯醇的浓度为m，则不会产生任何光亮，但如果……

提高温度后，就会产生发光现象。这与磷的特性极为相似。因此，邻苯二酚的“最大发光浓度”会随着温度的升高而增加。

我们已经知道，当存在H2O2时，邻苯二酚可以被多种物质氧化，比如马铃薯或萝卜汁中的过氧化物酶、血红蛋白、KMnO4、K4Fe(CN)6、CrO3、MnO2、次氯酸盐和次溴酸盐，以及胶体态的铂和银。为方便起见，我们可以将这些物质统称为氧化剂。它们被列在表13中。如果不存在H2O2，则不会产生光。对于某些氧化剂而言，低浓度的邻苯二酚会产生发光现象，而高浓度则不会；同样，低浓度的邻苯二酚与低浓度的氧化剂混合时会产生发光，但与高浓度的氧化剂混合时则不会。在这些情况下，温度的上升也会使邻苯二酚的“最大发光浓度”以及氧化剂的“最大发光浓度”增加。表11展示了K4Fe(CN)6与不同浓度邻苯二酚之间的温度效应，表12则展示了邻苯二酚与不同浓度K4Fe(CN)6之间的温度效应。表10则显示了邻苯二酚与各种氧化剂在温度变化时的发光强度关系。“微弱”、“较弱”、“较强”和“非常强”这些术语只是根据肉眼观察对亮度所做的相对描述，因为要精确测量微弱的发光强度是非常困难的。

从表10可以看出，用大多数氧化剂氧化后的邻苯二酚，在沸点时的发光强度实际上更低，这一事实我已经反复验证过了。现在让我们来探讨这些现象背后的原因。如果我们假设发光现象取决于反应速率，那么发光强度应该会随着温度的升高而增加。在某一限度之内，确实如此，但超过这一限度后，发光强度反而会下降。发光持续时间也会减少。在许多情况下，发光现象存在一个最佳温度，由此我们可以推断，发光现象并非取决于极快的反应速率，而是取决于某个特定的反应速率。既然如此，又该如何解释以下反常现象：在高浓度氧气环境中磷不会发光，或者在高浓度邻苯二酚环境中，即使有臭氧或氧化剂以及H2O2存在，也不会产生发光现象？当然，当氧气的活性很高时（在磷发光的情况下），或者邻苯二酚的活性很高时（在邻苯二酚发光的情况下），反应速率必然会超过最佳值。如果是这样的话，降低温度就应该能使反应速率回到最佳值，从而产生光。然而，正如我们所看到的，高浓度氧气或高浓度邻苯二酚环境下产生发光现象时，是温度上升而非下降起到了作用。

表11
温度、邻苯二酚浓度与发光现象。等量情况下

m/20：将K4Fe(CN)6与焦性没食子酸以及3%的H2O2混合。
焦性没食子酸的浓度及温度：0-2°、10°、20°、30°、50°、75°、98-100°。
反应效果：非常差、差、良好、微弱、一般、微弱。

m/4：反应效果为负值、微弱、微弱、微弱、良好、明亮、良好、明亮。

m/40：反应效果为微弱、一般、良好、良好、良好、明亮、闪光、明亮、一般。

m/400：反应效果为微弱、一般、良好、良好、良好、明亮、闪光、明亮。

m/4,000：反应效果为明亮、明亮、明亮、明亮、负值、闪光、闪光。

表12：铁氰化物的浓度、温度与发光情况。将等量的K4Fe(CN)6与m/100浓度的焦性没食子酸以及3%的H2O2混合。
K4Fe(CN)6的浓度及光照后的温度：0-2°、10°、20°、30°、50°、75°、98-100°。
反应效果：微弱；在20°C时达到半饱和状态，反应效果为负值、微弱、一般、一般、良好、良好、闪光；反应效果非常好；在20°C时达到六分之一饱和状态，反应效果为一般、良好、良好、明亮、微弱、明亮、闪光。

表13：与焦性没食子酸及过氧化氢一起能产生光的物质。将等体积的这些物质加入混合物中后，会产生光：浅蓝色、蓝色，同时会有氧气释放出来。具体来说，1份m/100浓度的焦性没食子酸或1份3%的H2O2与1份焦性没食子酸混合后，再加上H2O2，就会产生光。

最终混合物的浓度为给定值的一半：
- 氯化钾（K4Fe(CN)6）：1级，颜色明亮，反应迅速。
- 氰化亚铁（浓度为M/10至M/20）：2级，颜色很淡，反应极慢。
- 氰化铁(III)（浓度为M/10至M/1,250）：3级，颜色良好，反应迅速。
- 铬酸钾（K2CrO4）：4级，颜色良好，反应迅速。
- 重铬酸钾（K2Cr2O7）：5级，颜色良好，反应迅速。
- 高锰酸钾（KMnO4）：6级，颜色明亮，反应缓慢。
- 氢氧化钾（KOH）：7级，颜色很淡，反应极慢。
- 氯酸钾（KClO3）：8级，无颜色变化，反应极慢。
- 过硫酸钾（K2S2O8）：9级，无颜色变化，反应非常缓慢。
- 硫酸铬·硫酸钾复合物：10级，颜色很淡，反应极慢。
- 硫酸铵(Fe2(SO4)3·(NH4)2SO4)：11级，颜色一般，反应缓慢。
- 氯化铁(III)（FeCl3）：12级，颜色一般，反应缓慢。
- 硫酸亚铁(FeSO4)：13级，无颜色变化，反应非常缓慢。
- 硫酸铜(CuSO4)：14级，颜色明亮，反应迅速。
- 重铬酸（CrO3）：15级，颜色很淡，反应缓慢。
- 氯水：16级，有颜色变化，反应迅速。
- 溴水：17级，有颜色变化，反应迅速。
- 碘化钾中的碘：18级，有颜色变化，反应迅速。
- 次氯酸钠水溶液：19级，有颜色变化，反应迅速。

钠（NaOBr，溴）：微弱闪光，20 + ++；次溴酸盐水+NaOH：明亮。
钠：21（KI中的I+NaOH）：微弱 + +；次碘酸盐。
钙：22（饱和的Ca(OCl)2溶液）：良好 + ++；次氯酸盐溶液。
萝卜汁：23：明亮，- + ++。
加热至70℃后的萝卜汁：24：微弱，- +，反应非常缓慢。
煮沸后的萝卜汁：25：无变化，- - - - -。
白蛋白溶液：26：无变化，- - - - -。
白蛋白溶液+KMnO4：27：良好，+ - ++；煮沸1分钟后过滤仍为良好状态，无沉淀生成。
明胶溶液：28：无变化，- - - - -。
明胶溶液+KMnO4：29：良好，- - ++；煮沸1分钟后过滤仍为良好状态，无沉淀生成。
胶体银：30：明亮，+ +。
胶体铂：31：明亮，+ +。
稀释后的胶体Fe(OH)2：32：无变化，- - - + -。
肝源钠核蛋白酸盐：33：无变化，- - - + -。
乳腺源钠核蛋白酸盐：34：无变化，- - - - -。
酵母源钠核蛋白酸盐：35：无变化，- - - + -。
乌贼血（Sepia esculenta）：36：表现一般，++，含有血蓝蛋白。
煮沸后的乌贼血：37：表现良好，-。
日本龙虾血（Palinurus japonicus）：38：微弱，++，含有血蓝蛋白和脂色素四烯红素。
煮沸后的日本龙虾血：39：表现一般，-。
环节动物血（Laonome japonica）：40：表现良好。

含有氯血蓝蛋白。
煮沸后的环节动物血液（日本链虫）。
发光羽枝藻提取物。
44 – – – + ++ （Cavernularia haberi）
发光介形虫提取物。
45 – – + （Cypridina hilgendorfii）
发光原生动物提取物。
46 – – – – – （Noctiluca miliaris）
萤火虫（Luciola viticollis）。
47 – – ++ 发光器官提取物。
亚铁氰化铁。
48 (Fe Fe(CN)2) – 微弱 + +
49 氰化锌（Zn2Fe(CN)6）– – + 非常缓慢
50 氧化铬（Cr2O3）– – – 缓慢
51 氢氧化铬（Cr(OH)2）– – – 缓慢 +
52 二氧化锰（MnO2）– 效果良好，缓慢，缓慢 ++

我认为这些现象的解释应从另一个角度入手：反应物质的温度与浓度不仅会影响反应速率，还会影响反应产物。虽然发光强度确实会随着反应速率的提高而增强，但发光现象本身很可能只出现在一系列氧化产物形成过程中的某个阶段。在特定的温度和反应物质质量条件下，这一阶段才会更容易发生。因此，在磷的氧化过程中会形成多种中间氧化物。氧化是分步进行的，而发光现象则可能与这一系列反应中的某一步有关。某种特定的氧分压和温度有利于该步骤的发生，从而抑制其他步骤的进行，因此这样的氧浓度和温度就是发光的最佳条件。

“必须形成特定的邻苯二酚氧化产物才能产生光”这一假设得到了证实——因为只有以特定方式氧化邻苯二酚才能使其发光。在碱性条件下，邻苯二酚吸收氧气后会变黑，这是一个众所周知的反应，但这种氧化过程并不会伴随发光现象。我尝试过将不同浓度的邻苯二酚与不同浓度的碱混合，试图产生光，但始终没有成功。同样，我也尝试过通过含邻苯二酚的盐溶液的电解，并利用新生氧来产生光，但同样没有成功。

各种类型的阳极均未能产生预期效果。荧光素的情况也是如此——它会在没有光照的情况下自发氧化（在碱性环境中氧化速度最快），只有在与荧光素酶一起被氧化时才会发出光。总结化学发光的动态特性可以发现：只有在特定的温度和浓度条件下以特定方式对物质进行氧化，才会出现某种发光现象；这很可能是由于氧化链中与发光相关的某个步骤得到了促进。如果温度和浓度有利于引发发光的那一步骤，那么更高的温度和更高的浓度就会使发光强度增加。现在让我们来看看会发光的生物体，研究温度以及反应物质（氧气、荧光素和荧光素酶）的浓度对发光的影响。我们已经知道，荧光素-荧光素酶混合物的发光始于极低的氧分压，且随着氧分压的升高，发光强度也会增加，但很快就会达到一个发光强度最大的氧分压值，此后再增加氧分压也不会使光线更亮。在这方面，发光强度与氧分压的关系曲线显然与血红蛋白的饱和度与氧分压的关系曲线非常相似。在10毫米汞柱的氧压下，血红蛋白的饱和度约为50％；在20毫米汞柱的氧压下为80％；而在远低于空气中的氧压（152毫米汞柱）的情况下则完全饱和。由于荧光素发光的最佳氧分压也远低于空气中的氧分压，因此无论向其中通入空气还是纯氧，荧光素-荧光素酶混合物的发光亮度都是一样的。要想获得过量的氧气，只需保持溶液处于空气饱和状态即可；而关于荧光素和荧光素酶浓度以及发光强度或持续时间的描述，都是针对过量氧气的情形而言的。那些研究氧压升高对发光动物影响的研究人员也得出了相同的结论：高浓度的空气或氧气并不会增加发光强度（Dubois和Regnard，1884年）。通过热水或冷水提取整个Cypridinas所得到的荧光素和荧光素酶粗制溶液的氢离子浓度相当稳定，约为pH=9，这一数值是通过电位法测定的。这类溶液具有很高的缓冲能力，且在荧光素氧化过程中pH值不会发生变化，因此这一参数能够自动得到控制。由于难以测量不断变化的低强度光线，因此无法给出具体的光强度数据，但可以确定以下事实：荧光素或荧光素酶的浓度越高，发光强度就越大；荧光素的浓度越高，发光持续时间就越长；而荧光素酶的浓度越高，发光持续时间则越短。

发光现象会持续存在。因此，如果我们将高浓度的荧光素与低活性的荧光素酶混合，就会产生持续半小时甚至更长时间的明亮光线，且亮度会逐渐减弱。高浓度的荧光素酶与低活性的荧光素则只会产生短暂的光亮，几乎立刻就会消失。高浓度的荧光素酶与高浓度的荧光素则会产生持续时间较长的强光，而低活性的荧光素与低活性的荧光素酶则会产生持续时间也较长的微弱光芒。

所有这些现象都可以通过将荧光素酶视为加速荧光素氧化的催化剂来解释，同时认为发光强度取决于反应速率，也就是氧化的速度。与磷和邻苯二酚的情况不同，荧光素酶或荧光素似乎并没有最佳浓度，不过随着发光物质的浓度不断增加，发光强度也会逐渐上升，直到动物腺细胞分泌的纯荧光素与纯荧光素酶相互接触为止。此时的亮度为最大值，虽然无法与白炽灯发出的光相媲美，但在光线充足的室内、没有直射阳光的情况下依然能够被看到。

温度对Cypridina生物发光现象的影响也印证了上述结论。对于给定的荧光素与荧光素酶混合物而言，随着温度的升高，发光强度会先增加，达到某个最佳值后才会开始下降。超过最佳温度后亮度下降的原因是荧光素酶发生了可逆的变化，导致其活性降低。在70℃左右（具体温度取决于各种条件），这种变化会变得不可逆，荧光素酶会发生凝固。在0℃时仍然会有光产生，但亮度远低于较高温度下的光，且颜色更为偏黄；而在最佳温度下产生的光则是蓝色的。高于最佳温度时的微弱光线同样呈现黄色调。我认为这种颜色差异是由于反应速率变慢所致——因为在室温下能发出蓝色光芒的荧光素与荧光素酶混合物，若用水稀释后，其发光强度会降低且颜色会变得更黄。加水稀释会减缓反应速率。如果颜色差异并非真实存在，而是由于眼睛对不同强度的微弱光线的敏感度不同所导致的（即普金耶现象），那么较弱的灯光应该会显得更蓝。但由于实际观察到的较弱光线是黄色的，因此我认为这种颜色差异是真实的，而非主观感受。

所有的发光生物都存在发光的最低温度、最佳温度和最高温度。最低温度通常非常低，甚至在-11.5℃时，发光细菌仍能发光。在正常条件下，发光能力并不会因暴露在液氮中而丧失，因为只要提高温度，光就会再次出现（McFayden，1900，1902）。几乎所有的生物在0℃时都能发光，而发光强度的最小值很可能对应着物质完全冻结的临界点。

此时就会出现发光现象。由于细菌存在于尺寸极小的毛细空间中，其浓度非常低，而这种条件会降低冰点。发光强度达到最大值时，意味着荧光素酶发生了可逆的变化，从而不再具有活性。如果温度再次下降，荧光素酶又会重新变得活跃，光线也会再次出现。在略高于此温度且远低于沸点的范围内，荧光素酶会发生凝固并被破坏。由于蛋白质的凝固点受许多因素的影响，如加热时间、盐分含量、酸度等，因此不同动物的荧光素酶会在不同的温度下发生凝固。表14汇总了有关这些临界温度的一些较为可靠的观测数据。

表14　发光生物的发光温度范围

| 生物名称 | 研究者及日期 | 最低温度 | 最适温度 | 最高温度 |
|----------|--------------|----------|----------|----------|
| Pseudomonas javanica | Eijkman, 1892 | -20° | 25-33° | 45° |
| Bacterium phosphorescens | Lehmann, 1889 | -12° | … | 39.5° |
| Bacterium phosphoreum | Molish, 1904 | -5° | 16-18° | 28° |
| Light bacteria | Tarchanoff, 1902 | -7° | 15-25° | 37° |
| Light bacteria | Harvey, E. N., 1913 | -11.5° | 15-20° | 38° |
| Mycelium X | Molish, 1904 | … | 15-25° | 36° |
| Lampyrids | Macaire, 1821 | -10° | 33° | 46-50° |
| Pyrophorus noctilucus | Dubois, 1886 | … | 20-25° | 47° |
| Photuris pennsylvanica | Lund, 1911 | … | … | 50° |
| Luciola viticollis | Harvey, E. B., 1915 | <0° | … | 42° |
| Cypridina hilgendorfii | Harvey, E. N., 1915 | <0° | … | 52-54° |
| Cyclopina gracilis | Lund, 1911 | … | … | 50° |
| Phylirrhoë bucephalum | Panceri, 1872 | 44° | … | 61° |
| Pyrosoma | Panceri, 1872 | <0° | … | 60° |
| Mnemiopsis Leidyi | Peters, 1905 | 9° | 21° | 37° |
| Noctiluca miliaris | Quatrefages, 1850 | 1° | … | 40° |
| Noctiluca miliaris | Harvey, E. B., 1917 | <0° | … | 48° |
| Cavernularia haberi | Harvey, E. N., 1915 | <0° | … | 52° |
| Watasenia scintillans | Shoji, R, 1919 | … | 16-31° | 49° |

由此我们可以得出结论：发光强度取决于荧光素的氧化速度，而当反应速度降低时，光线的光谱组成也会发生变化，最大发射波长会向黄色偏移。不过我认为，在Cypridina中，发光强度不仅取决于反应速度，还取决于荧光素被氧化的具体方式。

萤光虫荧光素只有在萤光虫荧光酶存在时才会发光；而单独使用萤光虫荧光素，或是与各种能够氧化邻苯二酚的氧化剂（无论是否含有H2O2）一起使用，都不会产生光。萤光素在空气中也会自发氧化，但不会发出光。很容易证明，这种自发氧化的反应速度可能远快于在荧光酶作用下的氧化反应，但却只有在荧光酶存在时才会出现光。如果将高浓度的萤光素溶液置于接近沸点的温度下，它会在四到五分钟内完全氧化为氧代萤光素；此时即使通入空气或纯氧气，也不会有光产生。而将同一溶液置于20℃环境下，并加入少量荧光酶，它就会持续发光，且半小时内也不会完全氧化为氧代萤光素。不过，我们可以通过在20℃环境下加入高浓度的荧光酶，让萤光素以与接近沸点时相同的快速速度发生氧化反应——前者会发出明亮的光，后者则不会。由萤光素自发氧化产生的氧代萤光素，似乎与在荧光酶存在下产生的氧代萤光素相同；这两种氧代萤光素在还原后都会重新变成萤光素。也许这一反应是分两个阶段进行的，类似于其他酶促反应的机制：萤光素 + 萤光酶 = 萤光素-荧光酶复合物；萤光素-荧光酶复合物 + O（或H2）= 氧代萤光素 + 萤光酶。

因此，我们可以暂时假设：发光现象仅发生在荧光素与荧光酶复合物发生氧化反应时（即氧的加入或氢的去除）。我们刚刚看到，将含有荧光素和荧光酶且能发出蓝光的萤科昆虫提取物冷却后，其发光强度会降低，颜色也会向黄色偏移。氧化反应的速度会减慢，而在荧光酶浓度不变的情况下，速度的降低意味着会有更多波长较长的光产生。通过使用具有不同颜色的萤火虫来进行实验，也可以很好地了解光的颜色变化——这些萤火虫的荧光素与荧光酶能够相互反应。美洲萤火虫中的Photinus和Photuris就是这样的例子：Photinus发出橙色光，而Photuris则发出黄绿色光。当将这两种萤火虫的发光器官分别研磨后，颜色差异尤为明显。正如Coblentz所证明的那样，这种颜色差异是真实存在的，Photinus的光谱比Photuris的更偏向红色（见图8）。我们可以很容易地从这两种萤火虫中提取出荧光素和荧光酶，进而制成以下混合物：Photinus荧光素×Photinus荧光酶=红光；Photinus荧光素×Photuris荧光酶=黄光；Photuris荧光素×Photuris荧光酶=黄光。

Photuris luciferin与Photinus luciferase结合后会发出红色光。因此，这些“杂交体”所发出的光的颜色，实际上取决于提供luciferase的动物种类。为了将这一事实与我们之前关于反应速度和发光特性的论述相一致，我们必须认为Photinus luciferase的氧化速率比Photuris luciferase更慢。值得一提的是，当昆虫处于高温环境中，或者被浸入酒精中时，它们发出的光会变成红色——这两种情况都会导致luciferase部分凝固，从而降低其活性。

参考文献

以下列出了大量关于发光现象的论文中的部分内容。这些文献主要涉及发光动物的结构、化学性质或生理特性以及它们所发出光的物理特性，此外还包含少量具有普遍意义的文章。关于光与发光现象的更为全面的著作被放在最前面，而原始研究论文则紧随其后。作者姓名按字母顺序排列，他们的论文则按时间顺序排列。Mangold在1910年给出了涵盖整个生物发光领域的较为完整的参考文献列表。Dubois在1913年发表的文章则列出了他迄今为止所发表的所有研究成果，因此下面仅列出那些被特别提及的论文。

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索引

阿贝格，R.，147
棘壳类，78
蘑菇属，99
阿加西兹，A.，11
苯丙酮尿症，17
奥尔曼，G. I.，11，71
氨气，12
阳极发光现象，26，29
阿诺纳洛普斯，69
阿里斯提乌斯，72
亚里士多德，1

巴赫，A.，137
发光细菌，2，10，13，14，16，18，28，45，53，61，65，69，72，74，81，82，89，99，101，103
细菌灯，18
贝克，J.，2
班克罗夫特，W. D.，36
班克罗夫特与魏瑟，24
班德罗夫斯基，E.，33
巴克罗夫特与希尔，98
巴尔内亚，116
巴泰利与斯特恩，115
贝克勒尔，E.，26
贝杰林克，M. W.，18，89，99，100，102
比奇洛，S. L.，34
布莱克，91
博利托菲拉，77
博伊尔，R.，1，16，85及以后
布兰特，36
海星或蛇尾类，10，11，72

坎顿磷，27
二氧化碳与发光现象，91及以后
心脏蛤属，116
卡斯卡里奥洛，V.，27
阴极发光现象，26，29
洞穴藻类，74，103
森特纳茨韦尔，M.，147
头足类或鱿鱼，10，11，13，68，72，84，104
角海鞘，71
凯托普特鲁斯，10，17，42，71，73，74，83，103

化学发光，36页及以后，45页及以后
动物光产生的叶绿素，66
色藻，15
Chun, C.，79
Coblentz, W. W.，30、31、44、51、52、59、60、62、64、93、160
辅酶，104、130
共荧光素酶，107页及以后
动物光的颜色，41页及以后，157页及以后
浓度与发光现象，145页及以后
Conroy, J.，43
Crozier, W. J.，71、103
甲壳类动物，10、14、68、70、72、89、101页及以后
晶体发光，33页及以后，74
栉水母，2、10、11、71、72、82
氰化物与发光现象，126
Cypridina，14、30、45、48、63、71、73、75页及以后，90、92、98、103、105页及以后，155页及以后

Dahlgren, U.，72、73、75
“死亡之光”，69
甲藻，2、10、32、82
Dubois, R.，31、35、37、43、45、49、61、64、73、103页及以后、111、114页及以后、131、155

蚯蚓，10
动物光的效率，48页及以后
会发光的卵，11
电致发光，24、29
会发光的胚胎，11
Euphasia，72
Ewan, T.，147
Exner, S.，30
细胞外发光现象，68、71
会发光的眼睛，15页及以后

Fabre J. H.，99
Fahrig, E.，37
萤火虫，10、31、34、43、69、71、77页及以后、89、93、101、103、135、160
鱼类，1、3、10、18、64、69、72、84、85
花朵的闪光现象，16
荧光，25页及以后，62
荧光屏，29
Forsyth, R. W.，53
Frankland, P.，62

弗里德贝格与多普纳，65
发光青蛙，13
真菌或担子菌，10、69、72、81、89、99、101

加洛韦与韦尔奇，84
格恩兹，D.，32
吉亚尔与比莱，13
吉斯布雷希特，W.，11、70
萤火虫，1、10、43、77
颌头虫类，72
戈斯，B. C.，143
格林，C. W.，70
吉南什，37

H离子浓度与发光现象，92、138、155
热量产生与发光现象，93及以后
动物光源引起的向光性，66
赫勒，J. F.，1、2、16
异果属，72
异乌贼属，72
胡克，R.，91
赫尔姆，N.，1
海德、福赛斯与卡迪，57、63
氢化酶，131
氢油，10、72

“鬼火”，15
免疫体，104
被发光细菌感染的状况，13
动物光源中的红外线，48及以后
动物光源的强度，63
细胞内发光现象，68、71
干涉色，14
伊萨琴科，B.，66
艾夫斯，H. E.，28、44、51及以后、59、61

肯普，C.，78

兰利与维里，43、50及以后、64
兰克斯特，E. R.，42
拉瓦锡，91
伦纳德与沃尔夫，37
莉吉亚，13

鲎，129
林内曼，E.，36
洛德，A.，65
荧光素酶，103及以后内容，第六章（性质）；
Pholas中的荧光素酶，114；
Cypridina中的荧光素酶，123及以后内容
荧光素，31，110
荧光素酶，103及以后内容，第六章（性质）；
Pholas中的荧光素酶，114；
Cypridina中的荧光素酶，116及以后内容
Luciola，103，125
发光现象，23及以后内容
生物界的发光强度分布，3至12页
虚假发光现象，12及以后内容
会发光的动物，其栖息地，10页
会发光的动物对人类的用途，17及以后内容
发光颗粒，73，75
莱曼射线，21
光致发光现象，35

麦卡特尼，J.，2，3
麦克法登，A.，157
巨型酶，73
人类的发光特性，16页
曼戈尔德，E.，11，72
马萨尔特，J.，71
马斯托，S. O.，69
梅约，91
麦克德莫特，F. A.，31，37，45，53
麦肯尼，R. B.，100
水母或 Jellyfish，2，10，72，82
甲烷，15页
米夏埃利斯，G. A.，1页
“肉眼可感知的最小辐射强度”，65，144页
莫利施，H.，45，53，61，66，102页
软体动物，10，72页
单中心型生物，69，104页
摩尔，B.，71页
村冈，H.，61页
多足类动物，10，35，72页
贻贝，116页

纳德森，G.，66
线虫细胞，72
夜光藻，2、10、71、73、82、83、89、104
夜光素，101
纳廷，P. G.，57、59
夜光贝类，72、80

齿形虫，83
奥尔凯斯蒂亚，13
奥里亚属，35
奥斯本与韦克曼，121
牡蛎壳类，116
奥托，M.，37
氧气与发光现象，1、67、85及以后页、147及以后页
氧化荧光素，108及以后页、127及以后页、158
木质部发光现象，36及以后页、111及以后页

发光颜料，28、29
潘切里，P.，45、74
巴斯德，42
动物光源中的穿透辐射，61及以后页
羽状海笔，74、103
羽状海笔类，10、72、74、82、83、89、101、103
佩里迪纳科类，10
发光的周期性，71
佩龙，F.，45
过氧化物酶，11、126、148
彼得斯，A. W.，11、71
普吕格，E.，1、102
萤光虫，41、42
菲利普斯，A. H.，125
菲洛西亚属，13
菲普森，T. L.，101、109、110
Pholas属，10、11、72、73、74、89、101、103、105及以后页、114及以后页、131
磷气，15
磷光现象，24、25及以后页、138、143
磷光镜，26
磷光摄影法，52
磷与发光现象，38、39、147及以后页
Photinus属，44、51、53、56、59、64、103、125、160及以后页
光致眼睑闭合现象，18、64、69
光化学反应，67、68、138、145

光敏素，102
光敏苷，105
光致发光，26，67
光蛋白，105，106，110
动物利用光进行光合作用，18
Photuris属，44，59，103，125，160及以后
Pierantoni, V.，13，14，74
压电发光，32及以后
偏振现象，45
Polimanti, O.，45
Pope, W. J.，32
Porcellio属，13
Porichthys属，70，83
前荧光素或原始荧光素，106及以后
Prevost, B.，15
Priestly，91
Ptychodera属，71，103
普金耶现象，40，44，157
邻苯二酚与发光现象，37，111，148及以后
热致发光，24
火磷素，31，109
Pyrophorus属，11，43，45，49及以后，64，76，101，103，114，125
Pyrosoma属，10，13，45，72，101

Quatrefages, A. de.，73

辐射能，20及以后
放射性发光，26
镭射线或贝克勒尔射线，21，26，30，62
Radziszewski, B.，37，39
反应速率与发光现象，145及以后
还原酶，130及以后
Reeves, P.，65，144
呼吸作用与发光现象，91，92，99
Rhizomorpha属，2
Romberg磷，32
Russel, E. J.，147
Russel, W. J.，62

Sapphirina属，14
Sarcina属，1
Scharff, E.，147

谢勒，91
裂足纲动物，15
裂足类幼虫，11
舒曼射线，21
舒里格，W.，61
马陆，102
海洋的生物发光现象，2
海蛞蝓，72
塞尔盖斯忒斯，72、78
辛格与毛利克，61
比目鱼，116
斯帕兰扎尼，L.，85、101
化学发光的光谱，39
发光生物的光谱，42及以后
磷光的光谱，28
光谱的范围，21及以后
棘状镜，30
施泰赫，O.，65、69
斯特凡-玻尔兹曼定律，22、23
刺激与发光现象，68及以后、135
斯托克定律，28、31
斯蒂洛基龙，72
苏克斯兰德，E.，61
硫化物的生物发光现象，27
发光的汗液，17

塔利特鲁斯，13
塔尔查诺夫，J.，13
温度与发光现象，145及以后、156及以后
温度辐射，23
塔乌马托兰帕斯，42
热致发光现象，24及以后
托莫普特鲁斯，72
几丁质对红外线的透射性，52
特劳茨，M.，32、33、37、39、145
摩擦发光现象，32及以后
特罗扬，E.，11、78
楚加耶夫，L.，32

动物体内的紫外线，53及以后
发光的尿液，18
发光器官的用途，81及以后

液泡小体，73
范赫尔蒙特，91
范特霍夫，J. H.，147
弧菌，65
维勒与德里安，111
视觉敏感性，54及以后页

渡边H.，75
瓦塔塞尼亚，104
水与发光现象，85、101
魏瑟，H. B.，33、34、39
韦尔克，W. H.，121
惠勒与威廉姆斯，77
维德曼，E.，23
维德曼与施密特，25、36
“鬼火”，15
会发磷光的木材，1、2、85
蠕虫或环节动物，3、72

X射线或伦琴射线，21、26、30、62

安达N.，75
杨，C. A.，43

扎卡里亚斯，O.，71
酶原颗粒，73

誊写者注：

文中出现的化学名称的罕见写法已被保留，例如用“atropin”代替“atropine”，用“asparagin”代替“asparagine”等。“Sidot blend”与“Sidot blende”的拼写可互换使用。在表示酸碱度的数值尺度时，全文均使用“PH”或PH（下标H），而现代标准写法应为“pH”。第173页中，Nutting, P. G.于1908年发表的文献的页码范围为261–2039页，这一信息来自原文，但很可能是错误的。对于格式上的细微错误以及缺失的标点符号（主要出现在参考文献部分），已在未作特别标注的情况下进行了修正。

文本的修改仅针对那些明显的拼写或排版错误，具体如下：
第ix页：将“Phoshorescence”改为“Phosphorescence”（见“II. 发光与炽热……磷光与荧光”部分）。
第ix页：将“Biozymoxyluminescence”改为“Biozymoöxyluminescence”（见“V. 化学反应”部分）。

《光产生原理，第一部分……》
“生物酶发光现象。”
第x页：将“chemi-luminescence”改为“chemiluminescence”，共出现两次
（反应速率与化学发光；温度与化学发光。）
第15页：将“th”改为“the”（鲜为人知的是Ignis fatuus。）
第26页：将句号移至括号之外，即“在受到光照之后（光致发光）。”
第29页：将“platino-cyanide”改为“platinocyanide”（钡铂氰化物荧光屏。）
第29页：补充了缺失的逗号（willemite（Zn2SiO4），Sidot混合物）。
第34页：补充了缺失的结尾引号（“很有可能，这种现象的成因在于……”）
第39页：在Na2CO3（邻苯二酚-甲醛-Na2CO3-H2O2反应）中，将上标“2”改为下标“2”。
第41页：“50米烛光”改为“50米烛光单位”（在0.5以下以及50米烛光单位以上，能见度会有所变化……）
第42页，表4：在表格标题及说明中将“Fraünhofer”改为“Fraunhofer”（夫琅禾费谱线）。
第47页，表5：将“Forster”改为“Förster”（细菌……Förster，1887年）。

第56页，图12的标题：将“Forsythe”改为“Forsyth”（位于Hyde、Forsyth和Cady之后）。
第72页：补充了缺失的闭合括号“软体动物（Pholas和Phyllirhoë）”。
第74页：“secretion”改为“section”（上皮组织中的某一部分含有大量能分泌黏液的细胞……）
第75页：补充了缺失的结束标点符号（至少有一个，很可能有两个，与光线的产生有关。）
第75页：“intra-cellular”改为“intracellular”（具有具有细胞内发光功能的光细胞的动物）。
第81页，图29的标题：补充了缺失的逗号（chr.1，色素细胞；……）
第87页：补充了缺失的闭合括号“（而且其密度之高使得它们能够持续发光。）”
第90页：“necesary”改为“necessary”（博伊尔也通过许多实验证明，空气是动物生存所必需的……）
第93页：“thermo-couple”改为“thermocouple”（使用热电偶作为测量仪器）。
第94页：“D”改为“B”（放置在一个装满水的大型杜瓦瓶中）。
第94页：“Thermo-couples”改为“Thermocouples”（先进的Thermocouples（L和M）……）

第97页：“thermo-couple”改为“thermocouple”（检流计刻度上显示的每个热电偶的读数……）
第100页：将“McKenny”改为“McKenney”（McKenney在1902年也发现了这一现象……）
第102页：将“misceable”改为“miscible”（不溶于水，但可与水混溶）
第103页：“demonstrate”改为“demonstrate”（我始终无法证明它们存在于发光细菌中；）
第104页：“thermolable”改为“thermolabile”（……并且需要一种热不稳定的互补物质——亚历克辛。）
第104页：再次将“thermolable”改为“thermolabile”（因为产生光需要热稳定性和热不稳定性两种物质……）
第105页：将“thermolable”改为“thermolabile”（用于这种热不稳定物质的荧光素酶即光敏蛋白……）
第111页：“preslence and H2O3”改为“presence of H2O2”（在H2O2存在的情况下，洛菲宁会被脊椎动物的血液氧化。）
第116页：将“or”改为“of”（……大约一天左右就会从溶液中消失。）
第116页：将“oxidizible”改为“oxidizable”（作为可氧化物质的荧光素类物质，应当首先被关注。）

第123页：“contrated”改为“concentrated”（1毫升浓化的荧光素）。
第132页：“coluciferase”改为“co-luciferase”（他现在认为它与自己的co-luciferase是相同的）。
第151页，表13：将重复的编号“10”改为“11”（11氯化铁）。
第151页，表13：将重复的编号“14”改为“15”（15硫酸铬）。
第151页，表13：在两个条目中将“minute”缩写为“min.”（煮沸1 min.以及过滤）。
第158页：“appear”改为“appears”（……然而只有在后者的存在下才会出现光。）
第162页：补充了缺失的标点符号。（关于光与发光的更完整的著作在前，原始文章则在后。）
第165页：补充了缺失的逗号（Dubois, R.：1918a，《关于荧光素的合成》。）
第165页：“Biophotogénesis”改为“Biophotogénèse”（M. Newton Harvey关于生物光生成的最新研究）。
第165页：“Biophotogénèsis”改为“Biophotogénèse”（关于生物光生成的进一步研究）。
第166页：“Oxydations geschwindigkeit”改为

“氧化速度”（关于磷的氧化速度……）
第166页：将“Radiumstrahlem”改为“Radiumstrahlen”（关于镭射线在动物组织中引发的磷光现象的一些观察结果。）
第166页：将“neiderer”改为“niederer”（关于低温条件下细菌的生长情况。）
第167页：将“nueue”改为“neue”（关于Tomopteridae类植物所具有的玫瑰花状发光器官，以及两种新的Tomopteris物种。）
第169页：为“Pflanzen-”加上缺失的连字符（关于植物界与动物界中的发光现象。）
第169页：将“Rucksicht”改为“Rücksicht”（特别考虑到医学诊断与治疗领域，维也纳。）
第170页：将“jord.”改为“jard.”（圣彼得堡帝国植物园公报。）
第171页：将“Lichtfaüle”改为“Lichtfäule”（会发出磷光的千足虫与木材的腐烂现象。）
第172页：将“Pfluger's Arch”改为“Pflüger's Arch.”（《Pflüger's Arch.》，第119卷，第583-601页。）
第174页：将“Bedentung”改为“Bedeutung”（……它们对呼吸作用原理的意义。）

第175页：将“Lazaro”改为“Lazzaro”。
（Spallanzani, Lazzaro: 1794, ...）

第176页：将“Leuchtvermogen”改为“Leuchtvermögen”。
（Ueber das Leuchtvermögen von Amphiura squamata, Sars.）

第177页：将“Triboluminescenz”改为“Tribolumineszenz”。
（Tschugaeff, L.: 1901, Ueber Tribolumineszenz.）

第179页：将“Bandromski”改为“Bandrowski”。
（Bandrowski, E., 33）

第179页：将“Baelli”改为“Batelli”。
（Batelli and Stern, 115）

第179页：将“Centnerswer”改为“Centnerzwer”。
（Centnerzwer, M., 147）

第179页：将“Fire-flies”改为“Fireflies”。
（Fireflies, 10, 31, 34,...）

第180页：将“Forsythe”改为“Forsyth”。
（Hyde, Forsyth and Cady, 57, 63）。

第180页：将“Flankland”改为“Frankland”。
（Frankland, P., 62）

第180页：将“Glow-worms”改为“Glowworms”。
（Glowworms, 1, 10, 43, 77）

第181页：将“Piezolumisescence”改为“Piezoluminescence”。
（Piezoluminescence, 32 ff.）

第182页：将“Stefan-Boltzman”改为“Stefan-Boltzmann”。
（Stefan-Boltzmann Law, 22, 23）

第182页：将“infrared”改为“infra-red”。
（几丁质对infra-red的透明度，52）
第182页：补充了缺失的参考文献编号。
（Weiser, H. B., 33, 34, 39）。
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*** 古腾堡电子书项目《动物的光之本质》结束 ***

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1.F.

1.F.1. 在创建Gutenberg™作品集的过程中，Gutenberg项目的志愿者和员工付出了大量努力，用于识别那些不受美国版权法保护的著作、对其开展版权调查、进行文字转录以及校对工作。尽管如此，Gutenberg™电子作品及其存储介质仍可能存在“缺陷”，这些缺陷包括但不限于数据不完整、不准确或损坏、转录错误、版权或其他知识产权侵权问题、有缺陷或已损坏的磁盘或其他存储介质、计算机病毒，或是那些会损害您的设备或导致其无法读取的计算机代码。

1.F.2. 有限保修与责任免除——除1.F.3段中所述的“更换或退款权利”外，作为Gutenberg™商标所有者的Gutenberg文学档案基金会，以及根据本协议分发Gutenberg™电子作品的任何其他方，均不对您因任何损失、成本或开支（包括法律费用）承担任何责任。您同意，对于因过失、严格责任、违反保修条款或违约行为所造成的损失，您除了可依据1.F.3段的规定获得赔偿外，别无其他救济途径。您还同意，即使您已告知对方可能存在此类损失，该基金会、商标所有者以及根据本协议进行分发的任何方仍无需为您承担任何实际损失、直接损失、间接损失、衍生损失、惩罚性损失或附带损失。

1.F.3. 有限的更换或退款权利——如果您在收到该电子作品后的90天内发现其中存在缺陷，您可以向提供该作品的人士寄送书面说明，从而获得相应款项的退款（如有）。如果您是通过实体介质获取该作品的，则必须将该介质连同书面说明一并退回。提供有缺陷作品的一方可以选择提供替代副本而非退款。如果您是通过电子方式获取该作品的，那么提供该作品的一方……

您可以选择获得第二次机会以电子形式获取该作品，以此代替退款。如果第二份副本仍有缺陷，您有权书面要求退款，且不再有进一步解决该问题的机会。

1.F.4. 除1.F.3段中规定的有限更换或退款权利外，本作品按“原样”提供，不附带任何形式的明示或暗示担保，包括但不限于适销性或适用于某种用途的担保。

1.F.5. 某些州不允许免除某些暗示担保，或限制某些类型的赔偿。如果本协议中的任何免责条款或限制违反了适用于本协议的州法律，则该协议应被解释为采用该州法律允许的最大程度的免责或限制。本协议中任何条款的无效或不可执行性不会导致其余条款失效。

1.F.6. 赔偿责任——您同意为基金会、商标所有者、基金会的任何代理人或员工、根据本协议提供古腾堡计划™电子作品副本的任何人，以及参与古腾堡计划™电子作品的制作、推广和分发工作的志愿者，承担因您的行为或过失而直接或间接产生的所有责任、成本和费用，包括律师费：(a) 分发本作品或任何古腾堡计划作品；(b) 对任何古腾堡计划作品进行更改、修改、添加或删除；(c) 由您造成的任何缺陷。

第2节：关于古腾堡计划使命的信息

古腾堡计划代表着以各种计算机可读取的格式免费分发电子作品，这些计算机包括过时的、老旧的、中型的以及新型的计算机。它的存在正是基于……

数百名志愿者的努力，以及来自各行各业人士的捐赠，共同推动了这一项目的进展。

志愿者们以及为他们提供所需支持的财政援助，对于实现古腾堡计划的目标至关重要，也只有这样，古腾堡计划的藏书才能一直免费供后人使用。2001年，古腾堡文学档案基金会应运而生，旨在为古腾堡计划及未来的世代创造一个稳定且可持续的发展环境。如需了解更多关于古腾堡文学档案基金会的信息，以及您如何通过自己的努力和捐赠来提供帮助，请参阅www.gutenberg.org网站上的第3节和第4节，以及基金会的相关介绍页面。

第3节：古腾堡文学档案基金会简介

古腾堡文学档案基金会是一家非营利性的501(c)(3)类教育机构，根据密西西比州的法律成立，并获得了美国国税局的免税资格。该基金会的联邦税务识别号为64-6221541。根据美国联邦法律及您所在州的法律规定，向古腾堡文学档案基金会捐款可享受税收减免。

该基金会的办公地址位于美国新泽西州蒙特克莱尔市Watchung Plaza 41号516室，邮编07042，电话号码为+1 (862) 621-9288。电子邮箱地址及最新的联系方式可在www.gutenberg.org/contact页面上找到。

第4节：向古腾堡文学档案基金会捐款的说明

古腾堡计划依赖于公众的广泛支持与捐赠，没有这些支持，它就无法继续履行自己的使命——增加那些可以以机器可读格式免费传播的公共领域作品及授权作品的数量，让尽可能多的人能够获取这些作品。

包括那些已经过时的设备。许多金额不大的捐赠（1美元至5,000美元）对于维持该机构在IRS处的免税地位而言尤为重要。

该基金会致力于遵守美国50个州所制定的关于慈善机构及慈善捐款的法律法规。各州的合规要求并不统一，要满足这些要求需要付出大量努力、处理大量文书工作并支付诸多费用。在没有获得相关合规性确认的地区，我们不会寻求捐款。如需捐款或了解某个特定州的合规状况，请访问www.gutenberg.org/donate。

虽然我们无法也不会在尚未满足相关要求的州寻求捐款，但我们知道并没有规定禁止接受来自这些州的自愿捐款者所提供的捐赠。

我们衷心欢迎国际上的捐款，但对于来自美国境外的捐赠在税务处理方面，我们无法给出任何说明。仅美国的法律就足以让我们的少量员工应接不暇。

请查看Project Gutenberg网站上的页面，以了解最新的捐款方式与地址。除了现金捐款外，还可以通过支票、在线支付或信用卡等方式进行捐款。如需捐款，请访问：www.gutenberg.org/donate。

第5节：关于Project Gutenberg电子作品的一般信息

迈克尔·S·哈特教授提出了Project Gutenberg的理念，即创建一个可供所有人自由共享的电子作品图书馆。四十年来，他在仅有少量志愿者支持的条件下持续制作并分发Project Gutenberg电子书。

Project Gutenberg电子书通常是由多个印刷版本整理而成的，而这些版本在美国均被确认为不受版权保护，除非……

其中包含了版权声明。因此，我们并不一定需要让电子书与相应的纸质版保持一致。

大多数人都是从我们的网站开始了解的，该网站提供了主要的PG搜索功能：www.gutenberg.org。

该网站还提供了有关古腾堡计划的各种信息，包括如何向古腾堡文学档案基金会捐款、如何参与新电子书的制作，以及如何订阅我们的电子邮件通讯以获取新电子书的相关信息。

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